Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Summary

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Abstract

Gekweekte embryonale en volwassen skeletspiercellen hebben een aantal verschillende toepassingen. De micro-ontleed explantaten techniek die in dit hoofdstuk beschreven is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van relatief grote aantallen proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. De auteurs gebruik hebben gemaakt van micro-ontleed Explantatie culturen om de groei eigenschappen van de skeletspier cellen te analyseren in wild-type en dystrofische spieren. Elk van de componenten van weefsel groei, kan namelijk overleving van de cel, proliferatie, veroudering en differentiatie worden geanalyseerd afzonderlijk gebruikmakend van de hier beschreven methoden. Het netto-effect van alle componenten van de groei kan worden vastgesteld door middel van het meten van explant uitgroei tarieven. De micro-explantatie methode kan worden gebruikt om de primaire culturen tot stand uit een breed scala van verschillende spieren types en leeftijden en, zoals hier beschreven, is aangepast door de auteurs aan de isolatie van embryonale skeletspieren voorlopers mogelijk te maken.

Uniek, hebben micro-explantatie culturen is gebruikt voor het afleiden van klonale (eencellige oorsprong) skeletspieren stamcellen (SMSC) lijnen, die kan worden uitgebreid en gebruikt voor in vivo transplantatie. In vivo transplantatie SMSC gedragen als functioneel, weefsel-specifieke, satelliet-cellen die bijdragen tot de skeletspieren glasvezel regeneratie, maar die ook worden opgeslagen (in de satelliet cel niche) als een kleine pool van ongedifferentieerde stamcellen, die opnieuw kunnen worden geïsoleerd in de cultuur van het gebruik van de micro-explantaat methode.

Protocol

Twee benaderingen kunnen worden gebruikt om proliferatieve skeletspiercellen isoleren. In de eerste spierweefsels zijn enzymatisch verteerd voorafgaand isoleren enkelvoudige cellen tot plating out ^1. De tweede methode is om stukken van spierweefsel explantatie in de cultuur om cellen te groeien tijdens de incubatie ^{2, 3.} De tweede methode is beschreven in dit protocol. Weefselkweek zelf heeft zijn wortels in explantatie cultuur. Het jaar 2007 was de 100ste verjaardag van de klassieke experimenten van Harrison, waarin hij neuron uitwassen verkregen door incuberen zenuw explantaten in opknoping druppels van lymfe ^4. Explantatie cultuur technieken zijn gebruikt en verfijnd in een verscheidenheid van verschillende contexten in de daaropvolgende 100 jaar als een middel van het genereren van proliferatieve primaire culturen van volwassen en embryonale cellen ^{4, 5.} Het principe achter de explantatie techniek blijft echter hetzelfde, het minimaliseren van de trauma van de primaire celisolatie door het handhaven van de drie-dimensionale structuur van de ouder weefsel tijdens de cruciale vroege stadia van de cel uitgroei, terwijl het verstrekken van de uitgroeiende cellen met een rijke voedingswaarde media om in te vermenigvuldigen. In skeletspieren is er een extra voordeel van het gebruik explantatie cultuur, omdat de handeling van het snijden het spierweefsel bootst spierweefsel trauma, de gebruikelijke trigger voor satelliet-cel activatie, migratie en proliferatie ^{3, 6.} Volwassen skeletspieren satelliet-cellen (ook wel myoblasten) zijn de proliferatieve stamcellen bevolking verantwoordelijk voor de spiervezels herstel en groei van ^7.

Skeletspieren explantaten dus na te bootsen de in vivo omgeving van de regenererende spieren en het stimuleren van stamcellen migratie en verdeeldheid. In het embryo, de meerderheid van de gewervelde skeletspieren (romp en ledematen spieren) is afgeleid van de somieten, hoewel somitomeres en kieuwbogen aanleiding geven tot de spieren van het hoofd ^{8, 9.} De myotoom kunnen worden geïdentificeerd als twee verschillende groepen van Myf-5 expressie stamcellen zich in het dorsale, mediale en laterale randen van de onderscheidende somiet, respectievelijk. Respectievelijk, deze cellen het genereren van de epaxial spieren van de rug, die differentiëren in situ, en de ventrale en laterale hypaxial spieren (benen, buik en ademhalingsspieren), die de migratie van de spier stamcellen uit het somiet ¹⁰ vereisen. Embryonale stamcellen spier migratie is onder de controle van Pax 3 ^11. Myf-5 expressie is essentieel voor de oprichting van de embryonale spieren en dit belang blijft tot postnatale spieren waar meer dan 98% van de geactiveerde satelliet-cellen brengen Myf-5 ^12. Myf-5 is dan ook een betrouwbare en specifieke marker van de prolifererende skeletspieren stamcellen bevolking in zowel volwassen als embryonale weefsels. Embryonale stamcellen spier (ook wel spiercel voorvaderen, skeletspieren voorlopers, myoblasten of zelfs embryonale satelliet-cellen) kunnen worden geïsoleerd van de somieten een vroeg stadium muis, kuiken en kikker embryo's ^13. Met het oog op myogene culturen te isoleren van de embryonale skeletspieren van oudere embryo's de auteurs hebben aangepast de gemicrodissecteerde explantaat techniek voor embryonale weefsels. Een soortgelijke benadering wordt gebruikt door Cossu et al.. ¹⁴ tot en met klonale celpopulaties van de embryonale somiet ¹⁴ te genereren.

1. In vitro Cultuur van de Cel van de skeletspieren Stem Cells (SMSC)

SMSC zijn cellijnen van enkele cel oorsprong die klonaal zijn ontleend aan het primaire skeletspieren explantatie culturen. Ze kunnen worden gekweekt met behulp van standaard weefselkweek methodologie als er voldoende zorg wordt besteed. Merk op dat, tenzij anders aangegeven, alle beschreven bewerkingen worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden met behulp van een laminaire stroming kap (klasse 1 of klasse 2 steriele kast) en alle cultuur reagentia worden opgewarmd tot 37 ° C in een waterbad voor gebruik.

1. Te brengen SMSC van vloeibare stikstof opslag (zie paragraaf 1.2 voor het invriezen van beneden-methode) cryovials moet snel worden ontdooid en de inhoud overgebracht naar 5 ml voorverwarmde (37 ° C) DF10 kweekmedium voor onmiddellijke centrifugeren (1000 g voor 3 min) om DMSO te verwijderen . De beste methode om cellen te ontdooien is door middel van herhaalde pipetteren van kleine hoeveelheden voorverwarmde kweekmedium in de flacon alvorens naar de centrifugebuis. Het proces van ontdooien cellen dient te worden uitgevoerd zeer snel, omdat gecryopreserveerd cellen bevatten 10% DMSO, die is giftig voor cellen bij kamertemperatuur (LD50 ongeveer 2 minuten).
2. Na centrifugatie het supernatant wordt verwijderd en de cellen worden gewassen door het opnieuw tot schorsing van de celpellet in een verdere 5 ml DF10, centrifugeer zoals voorheen.
3. De cel pellet wordt vervolgens gemengd voor de tweede keer met 5 ml van DF10 en de resulterende celsuspensie wordt overgebracht naar een kleine 25 cm ² plastic cultuur vessel.
4. Culturen zijn gehandhaafd op 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO ₂ in de lucht. Tenzij schepen worden gebruikt met een gefilterd dop moet de dop van de fles wat losser worden gedurende enkele uren zodat de lucht in de cultuur vat in evenwicht met de incubator en het kweekmedium verzuren. pH van het medium wordt bewaakt door middel van het opnemen van een fenol rode kleurstof pH-indicator in het kweekmedium.
5. Ontdooide cellen moeten altijd gecontroleerd worden 24 uur na plating en opnieuw gevoed met vers DF10 medium om de verwijdering van celresten en resterende gifstoffen zorgen (zie Nota's 1 en 2).

1.1. Subcultuur

Voor de gevestigde SMSC lijnen, wanneer de cellen ongeveer 95% confluentie bereiken, moeten ze worden verwijderd uit hun cultuur schip, verdund en geplaatst in een nieuw schip voor verdere groei mogelijk te maken. Deze subcultuur procedure kan worden bereikt door middel van een aantal verschillende enzymatische procedures, trypsine / EDTA werd het meest frequent gebruikt (zie noot 3). Het is gebruikelijk (en goede) gewoonte om cellen groeien in dichtheden, die verplicht in deze gevallen subcultuur op de derde dag van de groei. Voor de meeste sms-cellijnen dit kan worden bereikt door het splitsen van cellen 1 / 10 bij elke subcultuur. Dit maakt een zorgvuldige monitoring van cellen en maakt het de uitvoering van de weefselkweek onmiddellijk te identificeren ongewone groei van gedrag (bijvoorbeeld een snellere groei) die kunnen wijzen op fenotypische veranderingen in de cellijn zoals transformatie of vermindering van apoptose veroorzaakt door de aanpassing aan de kweekomstandigheden. Bovendien, een consistente en zorgvuldige subcultuur routine vermindert enorm de incidentie van dergelijke gebeurtenissen.

1. Voor subcultuur met behulp van trypsine (trypsinisation) schepen worden verwijderd uit de incubator en hun medium afgedankt door aspiratie.
2. Cellen worden vervolgens tweemaal gewassen met steriele calcium-en magnesium-vrij fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 10 ml per wasbeurt, verwijderd iedere keer door aspiratie.
3. De cel monolayer (25 mm ² fles) 1 ml een trypsine / EDTA wordt toegevoegd en links op de cellen bij kamertemperatuur gedurende 2 3 min. totdat de cellen beginnen te los te maken (zie noot 4). Scheiden Dit kan worden gezien door de ervaren gebruiker als kleine gaatjes vormen in het licht ondoorzichtige monolaag wanneer de kolf is gehouden om het licht (zie opmerking 5). Terwijl cellen moet worden trypsinised voor voldoende tijd om een ​​enkele celsuspensie te waarborgen, moet erop worden gelet niet overbelicht SMSC te trypsinisation, omdat dit zal resulteren in een hoge mate van celdood en slechte bevestiging wanneer de cellen worden opnieuw verguld.
4. Te stoppen met de trypsine reactie, serum-bevattend medium (DF10) wordt toegevoegd aan een minimum van 2 volume (dwz twee keer het volume van de trypsine-oplossing). Wanneer subcultuur een 25 mm ² fles is het handig om 9 ml DF10 toe te voegen in dit stadium. A 1 / 10 split van cellen kan vervolgens eenvoudig worden gemaakt door het verdunnen van 1 ml van de resulterende celsuspensie in een nieuwe 25 mm ² cultuur fles, samen met nog eens 9 ml vers DF10 medium. De overige cellen kunnen worden gebruikt voor mobiele uitbreiding (over te dragen aan een groter schip), gecryopreserveerd (zie paragraaf 1.2) of geteld en uitgeplaat in experimentele gerechten, putten of platen voor de proliferatie en overleving assays, differentiatie, groeifactor behandeling of andere doeleinden (zie hieronder).

1.2. Cryopreservatie van cellijnen en primaire culturen

1. Voor cryopreservatie cellen worden gescheiden van hun monolayer voor subcultuur (paragraaf 3.1.1) en gepelleteerd door centrifugeren (3 min bij 1000 g).
2. De bovenstaande vloeistof wordt verwijderd door aspiratie en cellen worden zorgvuldig en snel opnieuw gesuspendeerd in 10 ml bevriezen down mix (10% DMSO in DF10) voordat ze opnieuw worden gepelleteerd door centrifugeren.
3. Dit keer is de pellet is opnieuw gesuspendeerd in voldoende bevriezen downmix tot 0,5 ml celsuspensie zodat per cryovial (zie tabel 1) en direct geplaatst in 80 ° C gedurende de nacht.
4. Cryovials worden overgebracht naar vloeibare stikstof de volgende dag voor de lange termijn opslag (zie noot 6). Net als bij het ontdooien van de cellen, moet dit proces van cryopreservatie wordt uitgevoerd snel. Terwijl DMSO is beschermend voor de celmembranen tijdens het vriezen is het zeer giftig voor cellen op non-temperaturen onder het vriespunt.

1.3. Het bepalen van het aantal cellen

1. Voor het bepalen van de cel concentratie van een enkele cel suspensie (na subcultuur) een Neubauer hemocytometer kan worden gebruikt. Om ervoor te zorgen de nauwkeurigheid van het tellen van het dekglaasje moet veilig worden gemonteerd op de hemocytometer basis (zie opmerking 7).
2. Een kleine druppel celsuspensie wordt vervolgens dicht bij de rand van het dekglaasje geplaatst en zullen worden ingenomen door capillaire werking.
3. Cellen worden dan geteld met behulp van een omgekeerde microscoop met fase-contrast verlichting. Om de nauwkeurigheid van de laatste cel de concentratie, de c te verhogenells in de telkamer mogen elkaar niet overlappen, als ze de oorspronkelijke cel suspensie worden verdund en de cellen opnieuw geteld. Samenklontering moet worden vermeden door een grondige dissociatie van cellen tijdens de trypsinisation en 100-200 cellen over een bekende oppervlakte moet worden gerekend tot een nauwkeurige schatting van het aantal cellen te verkrijgen. Een handige methode met behulp van de Neubauer hemocytometer is om cellen te tellen in twee of meer 16 vierkante sets. Celdichtheid per milliliter wordt dan verkregen door de totale door het aantal getelde sets (bijv. 2) en te vermenigvuldigen met 10 ^4. Bijvoorbeeld, 100 cellen geteld meer dan 2 x 16 vierkante sets = 100 / 2 = 5 x 10 ⁵ cellen / ml.

2. Tot vaststelling van primaire Skeletal Muscle Microexplant culturen

Primaire micro-explantatie cultuur kan worden gebruikt om de SMSC isoleren van enige bereikbare skeletspieren waaronder de individuele spieren van de voor-en achterste ledematen, diafragma, rug-en buikspieren. De methode voor het afleiden van microexplant culturen van jeugdige en volwassen spieren wordt in detail beschreven door Smith en Schofield ³ en is vervolgens op grote schaal wordt gebruikt om SMS-cellen van jonge, volwassen en oude muizen spieren. De methode kan ook gebruikt worden voor het afleiden van gekweekte skeletspiercellen van vis ²⁴ en menselijke skeletspier (Rao en Smith, ongepubliceerd). Uitgroei van de SMSC van een muis spier microexplant wordt geïllustreerd in figuur 1a, b. De methode is aangepast voor de isolatie van embryonale spier voorloper cellen (zie hoofdstuk 3). De basismethode is als volgt:

1. Aseptische dissectie van target spier (s) van een vers gedode muis is bereikt met behulp van steriele instrumenten, een schone werkplek en liberale gebruik van 70% ethanol spray.
2. Geïsoleerde spieren worden gewassen door middel van twee wijzigingen van de DF20 medium en worden geplaatst in de frisse DF20 medium in een 60 mm ² schotel. Met behulp van een stereo-installatie dissectie microscoop spieren worden zorgvuldig gemicrodissecteerde onder steriele omstandigheden om vet, bindweefsel en bot uit te sluiten.
3. Schoongemaakt spier stukken worden vervolgens gesneden in 400 micrometer ³ kubussen, die, met behulp van juwelier s forceps, individueel worden geplaatst in het centrum 60 wells van een 96-wells plaat met 50 ul DF20 (zie toelichting 8). Putten worden gecontroleerd onder de microscoop en geplaatst in de incubator. De buitenste putten zijn gevuld met een zoutoplossing om uitdroging te voorkomen van de putjes die explanten (3).
4. Microexplant gehechtheid en uitgroei wordt gescoord na 24-48 uur incubatie en daarna met 48 tot 72 uur intervallen (afhankelijk van de snelheid van de groei van de spieren gekweekt).
5. Voor uitbreiding en isolatie van SMS-cellen, zou uitgroei culturen individueel worden gecontroleerd voor cellen met een overwegend SMSC-morfologie, dat wil zeggen sferische mononucleate cellen met een hoge refractivity die groeien in samenvoeging van clusters (zie figuur 3.1b).
6. Zodra explant uitgroei is gevestigd individuele putten worden gevoed (zie noot 9) door de toevoeging van 50 pi stappen van medium waarop het medium verzuurt gevolg van de toegenomen celdichtheid. Wanneer het goed vol is en celcultuur bijna confluent, worden bronnen gevoed door de vervanging van 50% van het medium telkens aan de instandhouding van "conditioneren" factoren afgescheiden door de cellen (zie opmerkingen over geconditioneerd medium onder klonen; paragraaf 2.1) te verzekeren. Te onderdrukken differentiatie, worden op 60-70% confluentie primaire explantatie uitwassen omgeschakeld in calcium-uitgeput medium te vervangen door DF20 medium voor calcium-uitgeputte DMEM/F12 (alle supplementen hetzelfde blijven) voor het voeden cellen ^3.
7. Explantatie geconditioneerd medium kunnen worden bereid uit culturen in dit stadium en opgeslagen voor gebruik tijdens de uitbreiding en het klonen van primaire SMSC (voor het klonen van methode, zie paragraaf 2.1, figuur 1c f). Culturen zijn subcultuur met behulp van de dispase methode (zie paragraaf 3.5).
8. Klonaal afgeleid SMSC kan worden geanalyseerd in vivo door intramusculaire injectie (figuur 3.1 GK) ^19.
9. Karyotypering kan worden uitgevoerd op klonaal afgeleid SMSC-lijnen naar de status van diploïde bevestigen (zie paragraaf 2.2, figuur 3.1 l) ^25.
10. Deze methode kan worden aangepast voor het kweken van embryonale spier (hoofdstuk 3).

2.1. Klonale Afleiding

Primaire explant myoblast culturen (figuur 1a, b) zijn een nuttig en nauwkeurig hulpmiddel voor het vaststellen van een verscheidenheid van verschillende parameters groei in wild-type en mutant skeletspieren. Klonale afleiding, de isolatie van een cellijn van een enkele cel, is een essentiële stap in de isolatie van de skeletspieren stamcellen en kan ook gebruikt worden om subkloon SMSC lijnen getransfecteerd met RNAi constructen of transgenen. Gevestigde SMSC en primaire explantatie culturen zijn sterk afhankelijk van de dichtheid en zal "CRA'sh "(los van de schotel en sterven) als uitgeplaat op een te laag celdichtheid. Dit komt omdat SMSC-versie oplosbare factoren die nodig zijn om de groei en overleving van de cel te houden. Voor een high-density cultuur te simuleren en het aanbod van deze factoren tijdens de klonen, zijn SMSC gekloneerd in self-geconditioneerd medium. De toevoeging van geconditioneerde medium bleek te zijn van essentieel belang, zodat individuele cellen te prolifereren in een geïsoleerde omgeving.

1. Geconditioneerd medium is bereid uit prolifererende SMSC gekweekt gedurende 48 uur tussen 33 en 75% confluentie.
2. De media waarin deze cellen worden gekweekt is verwijderd na 48 uur en gefilterd met behulp van een 0,2 micrometer spuitfilter, dit zorgt ervoor dat de steriliteit van het geconditioneerde medium en verwijdert alle resterende cellen en puin.
3. Dit geconditioneerd medium wordt gemengd in een 1:1 verhouding met vers kweekmedium (klonen medium, zie noot 10) en wordt gebruikt als voedingsbodems voor enkele cel klonen.
4. Om dit te bereiken eencellige verdunningen cellen worden gescheiden door een enkele celsuspensie door een zorgvuldige trypsinisation (opgericht SMSC) of dispase behandeling (primaire Explantatie culturen) en verdund tot een concentratie van een cel per 100 pi klonen medium.
5. 50 ul van deze cel suspensie kan vervolgens worden verzilverd in elk van het centrum 60 wells van een 96-wells plaat.
6. Cellen worden toegestaan ​​om door incubatie hechten bij 37 ° C in 5% CO ₂ voor 6 uur en elk putje wordt vervolgens zorgvuldig gescoord op de aanwezigheid van cellen. Wells met 0 of meer dan een cel worden verdisconteerd in dit stadium.
7. Putjes die een enkele cel bevestigd worden zorgvuldig genoteerd en de kolonie die uit deze cel is zorgvuldig gecontroleerd (dagelijks tijdens de eerste paar dagen) om dat er slechts een kolonie, afgeleid van een enkele cel, is aanwezig te verzekeren. Cellijnen waren alleen afgeleid van putjes die een cel. Figuur 1c-e illustreert de uitbreiding van deze een enkele cel afgeleid kolonie.
8. Zodra de kolonie bereikt samenvloeiing in de 96-well plaat kan worden subcultuur in een putje van een 48-well plaat.
9. De gekloonde cellijnen kan dan zorgvuldig worden uitgebreid naar 24 - en 6-well platen totdat er voldoende cellen beschikbaar zijn voor plaat in een 25 cm ² kolf.
10. De skeletspieren oorsprong van deze culturen kan worden aangetoond door de expressie van Myf-5 (figuur 1, onder f) of andere skeletspieren-specifieke merkers, zoals MyoD en Pax 7.
11. In dit stadium lijnen zijn bevroren neer voor verdere uitbreiding (zie tabel 1).

2.2. Karyotypering

Karyotypering is een belangrijke methode van monitoring cel fenotype. Cellijnen afgeleid door klonale afleiding moet worden karyotyped om ervoor te zorgen dat ze een diploïde chromosoom aanvulling bewaard zonder grove chromosomale herschikkingen die hun fenotype zou kunnen beïnvloeden.

1. Voor karyotypering cellen worden gekweekt tot de laat-exponentiële fase (80% confluent) in 25 cm ² kweekvaten (2 dagen na de subcultuur) om het aandeel van mitotische cellen in de cultuur te maximaliseren.
2. Vierentwintig uur voor karyotypering de cellen worden gevoed met 10 ml vers kweekmedium. 0,2 ml van 10 mg / ml colchicine (zie Toelichting 11) wordt vervolgens toegevoegd aan de cellen die voor een nog eens 1 uur geïncubeerd bij 37 ° C.
3. Na 1 uur, de cellen zijn onderworpen aan de normale trypsinisation subcultuur procedure, behalve dat zowel het kweekmedium en PBS wast behouden blijven om het aantal geoogste mitotische cellen te maximaliseren.
4. De gedissocieerde cellen behouden medium en PBS wast zijn gesponnen bij 1.000 g gedurende 3 minuten tot pellet de cellen en de supernatant verwijderd en weggegooid in de bleekmiddel.
5. De cel pellet wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 5 ml 0,0075 M kaliumchloride voor precies 4 minuten, voordat cellen weer gepelleteerd door centrifugeren.
6. Het merendeel van de supernatant wordt afgezogen, waardoor een kleine hoeveelheid (~ 50 tot 100 pi) in de buis voor re-ophanging. Resuspendeer cellen door flicking de basis van de falcon buis tot een cel suspensie wordt bereikt. De cellen worden vervolgens geplaatst op ijs en gefixeerd in vers gemaakte ijs-koud fixatief (methanol: ijsazijn in een 3:1 verhouding) als volgt: 10 ml fixatief is langzaam druppelsgewijs toegevoegd aan de cellen met behulp van een klein glas Pasteur pipet ( dit voorkomt dat cellen klonteren).
7. Cellen zijn geplaatst op ijs gedurende 30 minuten en daarna gepelleteerd door centrifugeren, waarna de cel pellet wordt opnieuw gesuspendeerd in 0,5 ml verse fixeermiddel.
8. Dia's worden geproduceerd door het droppen van de vaste celsuspensie op voorbereid dia's (zie paragraaf 3.2.2.1) gehouden in een hoek van 45 °. Om ervoor te zorgen goed gespreid metafase verspreidt de pipet moet worden gehouden ten minste 30 cm boven de dia.
9. Om dit te visualiseren chromosomen, zijn dia's gekleurd voor 2 min in Leishman's Beits, verdund met drie volumes van Gurr buffer pH 6,8 vlak voor gebruik.
10. Dia's worden gedroogd bij kamertemperatuur en gemonteerd DePex montage medium.

1. Glazen dia's (Premium microscoopglaasjes, VWR International, Verenigd Koninkrijk) worden voorbereid voor gebruik in de karyotypering protocol door ze 's nachts in een grote (glas) container van zwavelzuur.
2. Dia's worden dan geplaatst onder stromend water gedurende 8 uur en worden vervolgens opgeslagen in 70% ethanol tot de gewenste.
3. Voor gebruik moet slides worden gespoeld onder stromend water voor een verdere 30 minuten en aan de lucht gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur

3. Tot vaststelling van primaire Micro-explantatie Culturen van embryo's

Drie muizen stammen werden gebruikt om deze methode, wild-type (C57BL/10) samen te valideren met MDX-en CAV3KO (beide dystrofische mutanten). Het dystrofine-deficiënte mdx muis is ontstaan ​​spontaan in C57BL/10, werd deze lijn verkregen uit de Bullfield laboratorium in 1991 en is sindsdien voortdurend onderhouden in onze inteelt kolonie ^26. CAV3KO dystrofische muizen, die een mutatie in het caveoline-3-gen bevatten, werden gefokt op het C57BL/10 achtergrond voor tien generaties voordat het wordt gebruikt in deze studie ^27. Elke muis lijn genereerde een robuust reproduceerbare uitgroei, proliferatie en overleving profiel dat was embryonale stadium specifiek en verschilt per stam. De volgende protocollen werden aangepast voor embryo's van Smith en Schofield PN (1994) ^3, voornamelijk als in Merrick ^21.

3.1. Embryoteams

1. Voor het verkrijgen van geënsceneerde embryo's, zijn paren opgezet als natuurlijke (1:1) paringen en vrouwen gecontroleerd elke ochtend voor vaginale pluggen. Op de dag van de plug-detectie, worden embryo's geteld als E0.5 dagen (12 uur na bevruchting).
2. Zodra vaginale stekkers zijn gedetecteerd de mannetjes worden verwijderd uit de kooi om de nauwkeurigheid van de embryonale enscenering te verzekeren.
3. Als de gewenste embryonale stadium is bereikt (E11.5 tot E17.5), de moeders zijn gedood door cervicale dislocatie, de buik wordt geschoren, de huid en de omliggende gebieden gereinigd met 70% alcohol en de baarmoeder wordt verwijderd via een horizontale incisie in de buik gemaakt met behulp van steriele instrumenten ontleden.
4. De baarmoeder wordt dan een keer gewassen in het primair explantatie kweekmedium (PECM) voordat ze geplaatst in een kleine schotel met verse PECM voorafgaand aan de dissectie.
5. E11.5 te E17.5 embryo's worden ontleed uit de baarmoeder met behulp van een dissectiemicroscoop en geplaatst individueel in platen met PECM in gereedheid voor gedetailleerde microdissectie.

3.2. Embryo Microdissection

1. Individuele embryo's worden verder ontleed om gebieden die rijk zijn in de skeletspieren (zie Figuur 2a) te isoleren. Hind en de voorpoten (hypaxial skeletspieren) zijn ontleed uit, evenals de boven-en onderlichaam muur (voornamelijk epaxial skeletspieren). Om dit te doen een incisie over de lengte van de thorax, is abdomen en bekken gemaakt om de interne organen van het embryo te worden verwijderd.
2. Te verrijken voor embryonale stamcellen skeletspieren (eSMSc), zijn het hoofd, ruggenmerg en alle interne organen vervolgens verwijderd.
3. In oudere embryo's (E15.5-E17.5 embryo's) is het ook mogelijk om de huid en kraakbeen / bot weer te verwijderen om het aandeel van spiercellen te verhogen in de culturen.

3.3. Het opzetten van Embryo Microexplant culturen

1. Eenmaal voorpoten, achterpoten en de boven-en onderlichaam muren zijn ontleed komen dat ze worden geplaatst in frisse PECM en verder gemicrodissecteerde om kleine blokjes van weefsel van gelijke grootte (~ 0.5 mm ^3; Figuur 2a) te produceren.
2. Deze microexplants worden vervolgens naar het centrum 60 wells van een 96-well plaat (een explantatie per well) met 50μL PECM per well. Een minimum van 60 putjes die een explantatie per goed worden vastgesteld, per embryo bestudeerd.
3. Voor het kweken van embryo's het centrum 60 putten kan worden onderverdeeld in regio's aangeeft waar de explantatie werd afgeleid uit (Figuur 2b). Dit ontwerp maakt het mogelijk 15 wells elk respectievelijk voorpoot, bovenlichaam muur, achterbeen en een lagere body muur explantaten ^21.

3.4. Monitoring uitgroei

Uitgroei tarief is een betrouwbare maat voor de groei van embryonale skeletspieren explantaten en onder de zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden hier beschreven is in hoge mate reproduceerbaar.

1. Explantaten worden geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO ₂ voor 3 weken en scoorde op de 3e, 7e, 14e en 21e dag van het kweken met behulp van een omgekeerde microscoop. Explantaten worden gescoord op basis van het niveau van de samenvloeiing van de cellen in elk individueel goed (figuur 3a, e).
2. Fotografische beelden van culturen kunnen worden genomen, bijvoorbeeld met behulp van een SLR-camera verbonden met de microscoop en 100 ASA Fuji (kleur) of Kodak TMAX (zwart-wit) professionele film (figuur 3f).
3. Een skeletspier-specifiek antilichaam dat specifiek is voor Myf-5 kan worden gebruikt om de skeletspieren oorsprong van eSMSc aan te tonen, afhankelijk van de stam 80 95% van de cellen geïsoleerd gebruik van deze methode zijn Myf-5 positief. Andere merkers zoals MyoD en Pax 7 kan ook worden gebruikt om de skeletspieren oorsprong van deze celpopulaties te tonen. Hoewel deze cellen bevatten een zeer groot deel van embryonale stamcellen skeletspieren het niet kan worden aangenomen (vooral voor jonge embryo's), dat ze allemaal van de skeletspieren herkomst of dat ze allemaal stamcellen. Te isoleren pure stamcelpopulaties is het noodzakelijk om klonaal leiden primaire explantatie culturen zoals beschreven in paragraaf 2.1.

3.5. Subcultuur Primaire Embryonale Explantaten

Eenmaal samenvloeiende, Explantatie culturen weergeven van de morfologische kenmerken van de SMSC (Figuur 3f) kan worden subcultuur als volgt ^{3, 21:}

1. Kweekmedium wordt verwijderd uit de geselecteerde bronnen, gefilterd met een 0,2 um Acrodisc R_ spuitfilter en bewaard voor gebruik als geconditioneerde medium. Het medium kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 week.
2. 100 pi van dispase verdund 1:10 in PECM wordt toegevoegd aan elk putje en platen keerde daarna terug naar de 37 ° C incubator gedurende 20 minuten.
3. Een pipet wordt vervolgens gebruikt om voorzichtig schrapen het losgemaakte cellen van het oppervlak van de put.
4. De celsuspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 1.000 g gedurende 3 minuten tot pellet de cellen en de supernatant wordt verwijderd en weggegooid.
5. Cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 200 pi van 1:1 mix van geconditioneerd medium en PECM.
6. De cel mix is ​​overgebracht naar 48-well platen voor verdere expansie.
7. Voor de in vitro analyse-cellen kunnen worden uitgeplaat bij een dichtheid van 5 x 10 ³ cellen / cm ² ofwel in 48-well platen (elk met een 9 mm ² steriele glazen dekglaasje), of in 8-goed-glazen kamer dia's. Voor differentiatie analyse cellen 's nachts gegroeid tot 50-60% confluentie voordat ze worden overgebracht naar differentiatie tolerante medium (zie hoofdstuk 4 voor in-vitro-methode details) gedurende 3 dagen, voordat fixatie.

4. In vitro analyse van de skeletspieren stamcellen en primaire culturen

4.1. Voorbereiding van de cellen

1. Dispase subcultuur (paragraaf 3.3) primaire embryonale explantatie culturen zijn uitgeplaat in PECM / geconditioneerd medium op dekglaasjes in 48-well platen bij een dichtheid van 3 x 10 ³ cellen / cm ² en liet te hechten.
2. Voor de beoordeling van apoptose en proliferatie dekglaasjes worden twee keer gewassen in PBS, gefixeerd in 4% paraformaldehyde (zie paragraaf 4.2) in PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur, gevolgd door nog eens 10 minuten PBS wassen.
3. Coverslips voorbereid op deze manier kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week in PBS of PBS / glycine.

4.2. Voorbereiding van de Paraformaldehyde Fixatief

1. In een zuurkast, weegt 4 g paraformaldehyde (PFA, Sigma-Aldrich, VK) en toevoegen aan een glazen fles van 100 ml steriele PBS met een magneetroerder. Een gezicht masker en handschoenen moeten worden gedragen voor bescherming.
2. In een zuurkast, is de oplossing verwarmd en voortdurend geroerd op een magnetische kookplaat totdat het poeder oplost. Dit duurt ongeveer 5-10 minuten bij 65 ° C. Zorg moet worden genomen om de temperatuur stijgt boven 70 ° C te voorkomen, want er is een risico dat de oplossing exploderende bij hoge temperaturen.

4.3. Apoptose en proliferatie Assay

1. Vaste dekglaasjes (bereid zoals in paragraaf 4.1) zijn gekleurd met 10 ug / mL DAPI gedurende 3 minuten.
2. Coverslips zijn een keer gewassen in PBS (5 tot 10 min) en omgekeerd op een plek van vectashield montage medium op een glasplaatje ^{17, 18.}
3. De randen van het dekglaasje zijn afgesloten met nagellak (zie noot 12).
4. Voor opslag, zijn dia's verpakt in folie en geplaatst bij 20 ° C.
5. Voor het tellen van zijn dia's bekeken onder de fluorescentie (UV filter) op een rechtopstaande microscoop en scoorde voor de apoptotische en mitotische cellen met behulp van een oculairgraticule. Twintig willekeurig verdeeld roosters worden geteld (die ~ 1000 cellen), en cellen worden morfologisch gekarakteriseerd als niet-apoptotische, apoptotische of mitotische (figuur 3 g).
6. Mitotische en apoptotische indices worden berekend als een percentage van de totale cellen.

4.4. Immunohistochemie

Cellen bevestigd op dekglaasjes kan ook worden gebruikt voor immunohistochemie. Voor het antigen retrieval met behulp van een snelkookpan dekglaasjes moeten stevig worden bevestigd aan glas dia's met behulp van standaard paperclips. Immunokleuring kan worden gebruikt om prolifererende cellen te identificeren, met behulp van een antilichaam tegen Ki67 (1 / 1, 000 verdunning), om de identiteit vast te stellen, met behulp van een antilichaam tegen Myf-5 (1 / 1, 000 verdunning), of om genexpressie te onderzoeken (zieRubriek 4.5). Immunokleuring kan worden bereikt met behulp van een aantal methoden, de volgende (beschreven in (28, 29)) wordt routinematig gebruikt door de auteurs:

1. Natriumcitraatbuffer is voorverwarmd in de snelkookpan. Voor antigen retrieval, worden dia's met daarin coupes weefsel geplaatst in de verwarmde buffer en onder druk verwarmd gedurende 2 minuten. De druk wordt bereikt door stevig het blokkeren van de snelkookpan deksel en het op het gewicht. Zodra de 2 min ophalen tijd is verstreken de snelkookpan wordt vervolgens zorgvuldig onder koud stromend leidingwater om de druk te verminderen. Om te voorkomen dat de buffer koken up, moet erop worden gelet dat de deksel te verwijderen totdat de druk is gelijkgesteld met atmosferische druk. De druk is voldoende verminderd wanneer het gewicht gemakkelijk kan worden verwijderd (zonder geweld) en de klep is verwijderd. Dia's worden vervolgens verwijderd uit de buffer en gewassen in PBS kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
2. Dia's zijn vooraf geblokkeerd door ze onder te dompelen in 3% waterstofperoxide / kraanwater gedurende 5 minuten en vervolgens drie keer gewassen in PBS + 0.05% Tween 20 (10 min per wasbeurt).
3. Blokkering wordt bereikt door een 30 minuten incubatie in het blokkeren van TNB buffer (geleverd in TSA kit) bij kamertemperatuur.
4. Primair antilichaam wordt verdund in TNB buffer om de juiste verdunning (uitkomst van de titratie, zie Toelichting 12) en 's nachts geïncubeerd bij 4 ° C (of als alternatief 1 à 2 uur bij kamertemperatuur).
5. Na drie 10 min wassingen in PBS + 0.05% Tween 20, zijn dia's geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de juiste gebiotinyleerde tweede antilichaam verdund in TNB buffer.
6. Na nog eens drie 10 min wassingen in PBS + 0.05% Tween 20, dia's geïncubeerd gedurende 30 min in Streptavidine-HRP (voorzien in de TSA kit) verdund 1:100 in TNB buffer en vervolgens drie keer gewassen (10 min elk) in PBS + 0.05% Tween 20.
7. Biotinyl tyramide (versterking reagens, TSA-kit) wordt vervolgens toegevoegd aan elke sectie voor tussen de 8 en 15 minuten (de exacte tijd moet worden verkregen door optimalisatie experimenten).
8. Na de versterking, was dia's drie keer (10 min elk) in PBS + 0.05% Tween 20 en vervolgens incubeer gedurende 30 min in SA-HRP.
9. Na drie verder wassen (10 min elk) in PBS + 0.05% Tween 20, visualiseren met behulp van 3,3 _-diaminobenzidine tetrahydrochloride chromogeen (DAB) voor 5 tot 10 minuten. Vervolgens uit te voeren laatste twee wasbeurten in het water voordat tegenkleuring dia's in hematoxyline en afdekken. DAB is een bekend carcinogeen en dient met zorg behandeld worden (zoals Colchicine, paragraaf 3.2.2).

4.5. Differentiatie

1. SMSC uitgeplaat op dekglaasjes of kamer dia's (zie Toelichting 13) kan ook worden onderscheiden voor de fixatie voor myotube analyse.
2. Voor deze experimenten cellen worden uitgeplaat bij een dichtheid van 10 ⁴ / cm ² en mogen hechten voor 6 tot 8 uur
3. Cellen worden dan ingeschakeld in de differentiatie tolerante voorwaarden voor 3 dagen (zie toelichting 14).
4. Differentiatie medium is samengesteld uit DMEM + 0,5% FCS aangevuld met 2% paard serum en 1% glutamine. Deze differentiatie tolerante cultuur medium is vervangen bij 48 uur intervallen.
5. Coverslips worden dan gefixeerd in 4% paraformaldehyde zoals hierboven (artikelen 3.4.1 en 3.4.2).

4.6. Transfectie van SMSC: expressie van transgenen en shRNAi constructen

Stamcellen en primaire culturen zijn ongevoelig transfectie en met een meerderheid van de methoden van de transfectie tarief in SMSC-en primaire skeletspiercellen is zeer laag (<10%), het voorkomen van het gebruik van voorbijgaande transfectie methoden. Om dit het is de gangbare praktijk in ons laboratorium om klonale derivaten isoleren van transgene getransfecteerde culturen (zie paragraaf 3.2.1) na transfectie met calciumfosfaat of Lipofectamine. Als alternatief cellen kunnen efficiënt worden getransfecteerd met behulp van infectie van viraal verpakt constructen. Figuur 1m toont stabiele expressie van β-galactosidase in PD50A, een klonale SMSC afgeleide geïsoleerd onder G418 selectie na infectie met pIRV, een replicatie defecte retrovirus dragen de genen voor neo/G418 weerstand en β-galactosidase (19). Deze cellijn werd gebruikt om formeel aan te tonen dat SMSC zich gedragen als functionele stamcellen in vivo (zie figuur 3.1). Terwijl het genereren van een stabiele klonale cellijn die een marker-gen is het wenselijk dat in vivo stamceltransplantatie experimenten, het is een tijdrovende en onbevredigende manier van analyseren van gen-functie in vitro. Om deze redenen hebben de auteurs onlangs ontwikkelde een optimale aanpassing van de Lipofectamine 2000 transfectiereagens die in staat is het leveren van transfectie tarieven van 60 tot 70%. Hierdoor kan de analyse van gen-functie met behulp van transiënte transfectie van transgenen of RNAi constructen in SMSc of primaire explant culturen (figuur 3 uur, i). De auteurs gebruiken een short hairpin RNAi vector (pSHAG RNAi) (30) tot shRNAi constructies die in staat van gen-specifieke targeting van de mRNA-expressie in de SMSC te genereren. Het succes van de shRNAi techniek is afhankelijk van twee elementen: (a) een efficiënte transfectie methode en (b) het ontwerpen van een short hairpin sequentie die specifiek herkent de target-gen. Een shRNAi bouwen doorverwezen naar eGFP kan worden gebruikt om de RNAi knockdown methode (figuur 3j, m) te valideren.

4.7. Geoptimaliseerde LipofectamineTM 2000 Transfectie Protocol voor de SMSC

1. Cellen worden uitgeplaat op 05 tot ¹⁰ april cellen / cm ² in de kamer dia's in 250 ui DF10 kweekmedium en gekweekt gedurende 18 uur tot 95% confluentie (optimale samenvloeiing voor elke cellijn werd opgericht door het beoordelen van transfectie prijzen bij verschillende dichtheden) te bereiken.
2. Voor elke goed, is 0,5 ug DNA (shRNAi vectoren, transgenen) toegevoegd aan 33 ul van serum-vrij DMEM aangevuld met 2 mM glutamine en voorzichtig gemengd in een steriele Eppendorf buis.
3. Voor elke goed, is 1,25 ul van Lipofectamine 2000 afzonderlijk verdund in een verdere 33 pi van de serum-vrij medium DMEM + glutamine, voorzichtig gemengd en bewaard bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten
4. Het DNA en lipofectamine mixen worden dan snel bij elkaar opgeteld, voorzichtig gemengd gedurende 60 s door pipetteren en vervolgens geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 19 min om DNA Lipofectamine 2000 complexen te vormen.
5. Voor de transfectie, is 66 ul van complexe mix toegevoegd aan elke kamer goed en dia's zijn zachtjes geschud gedurende 10 s tot gelijkmatige verdeling van de complexen te verzekeren.
6. Cellen worden geïncubeerd gedurende 24 tot 72 uur bij 37 ° C en 5% CO _2. Afhankelijk van het construct, functionele genexpressie of shRNAi knockdown is eerst gedetecteerd tussen de 8 en 24 uur na transfectie.

5. Representatieve resultaten

Wanneer explantaten zorgvuldig zijn geëxplanteerd van volwassen skeletspieren of uit embryo's de explantaten zal beginnen om cellen binnen een paar uur tot 72 uur incubatie bij 37 ° C (5% CO ₂ / lucht) (Figuur 3A). Genereren De tijd die nodig om dit te laten gebeuren is afhankelijk van de bron van de explantaten: embryonale explantaten zal ontgroeien sneller dan oudere volwassenen skeletspieren explantaten. In onze ervaring de timing van de uitgroei is zeer reproduceerbare ^{3, 29.} Uitbreiding van de cel bevolking zal plaatsvinden over een periode van dagen (embryo explanten) of weken (oudere skeletspieren explantaten) naar een hoge dichtheid aggregeren van SMS-cel primaire culturen te genereren (zie figuur 3B-F voor de illustratie van deze culturen). Figuren 1 & 3 tonen representatieve resultaten van de succesvolle afleiding en de cultuur van de skeletspieren en embryonale explantaten, klonale afleiding en in vivo transplantatie van de skeletspieren afgeleid volwassen stamcellen, β-galactosidase etikettering, karyotypering en mijnb-5 immunohistochemie van embryonale SMSC aan skeletspieren oorsprong van het illustreren . de celpopulaties Figuur 3 toont een representatief resultaat van uitgroei scoren (met behulp van Myf-5 immunohistochemie om te visualiseren SMSC), de morfologie van embryonale spieren primaire cellen, DAPI kleuring voor apoptose en de shRNAi transfectie protocol. Verdere details zijn te vinden in de figuur legenden met betrekking tot deze twee cijfers. Figuur 2 illustreert de procedure van embryo micro-dissectie tot verrijkte populaties van embryonale skeletspieren stamcellen te genereren.

Tabel 1: Berekening tafel om het aantal cryovials vereist is voor maximale levensvatbaarheid van de cellen tijdens de celdeling te bevriezen schatting naar beneden protocollen

Plaat / Flask / kamer schuif	Volume van Kweekmedium	PBS wast	Volume van trypsine	Aantal bevriezen beneden flacons (3.1.2)
96-well	50 uL	2 X 100 uL	25 il	N / A
48-well	150 pi	2 X 200 pi	50 uL	N / A
24-well	500 pL	2 X 700 uL	200 pi	N / A
6-well	3 ml	2 X 3 ml	500 pL	1
Klein (25 cm 2)	10 ml	2 X 10 ml	1 mL	2
Medium (80 cm 2)	10 ml	2 X 10 ml	3 ml	4
Grote (175 cm 2)	10 ml	2 X 10 ml	5 ml </ Td>	8
Kamer goed	500 pL	2 X 500 pL	100 ul	N / A

N / A = niet van toepassing; cel aantallen te laag waren te bevriezen naar beneden, tenzij meerdere putjes werden bevroren naar beneden bij elkaar.

Figuur 1. Isolatie van de skeletspieren stamcellen (SMSC) van microexplants: (A) Vroege uitgroei van geëxplanteerd volwassen skeletspieren (dag 2) (B) Opgericht explantatie uitgroei zien geaggregeerde culturen en hoge celdichtheid.. Klonale afleiding van SMSC. (C) Single cel geïsoleerd in een 96 wells plaat. (D) Kolonie van enkele cel oorsprong. (E) opgericht klonale bevolking. (F) Verificatie van de identiteit met behulp van SMSC Myf-5 immunohistochemie. Cellen, afkomstig van SMSC-kloon PD50A (uiten van β-galactosidase) in het gastland muizen na 3 maanden (G) en (HJ) 14 maanden na de injectie van 2.000 PD50A cellen in muizen tibialis anterior spier. (G) Drie onlangs gefuseerd (centraal gelegen kernen ) β-galactosidase-positieve cellen (blauwe vlek) in spierweefsel (langsdoorsnede). (H) Uitgebreide bijdrage van β-galactosidase-positieve cellen (bruine vlek, gedetecteerd door anti-β-galactosidase antilichaam) spiervezels (dwarsprofiel ). (I) β-galactosidase-positieve satelliet cel (bruine vlek, gedetecteerd door anti-β-galactosidase-antilichaam). (J) secundair antilichaam controle (geen vlekken). (K) β-galactosidase-positieve cellen (blauwe vlek) woekeren in de cultuur als geïsoleerd van geïnjecteerde spieren gastheer 12 maanden na de injectie. (L) Karyotype van een muis klonale SMSC-lijn (DMN8) met normale diploïde chromosoom te vullen. (M) Histochemistry met β-galactosidase expressie in een kolonie van PD50A cellen ( figuur 3.1 g, k, gereproduceerd met toestemming van AACR pers, Smith en Schofield, 1997).

Figuur 2. (A) Illustratie van het embryo dissectie proces. Het cijfer geeft een E15.5 embryo waar bot primordiale (kraakbeen) gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en ontleed vrij van de omringende skelet spierweefsel. In dit stadium, en in later stadium embryo's (E15.5 E17.5), werd dermis ook verwijderd om het aandeel van de skeletspieren verkregen spiercellen te maximaliseren. (B) Instellen van primaire explantatie culturen in een 96-well plaat. Elk embryo werd gebruikt om een ​​plaat zoals hierboven afgebeeld te produceren. Gebruikelijk is tot op het bord een replica van de drie afzonderlijke embryo's (drie platen = 180 putten) om vast te stellen uitgroei tarieven.

Figuur 3. Embryonale primaire explant culturen werden gescoord op 3, 7, 14 en 21 dagen van cultuur en toegewezen een uitgroei niveau vertegenwoordiger van de samenvloeiing niveau. (AE) C57BL10 E15.5 primaire embryonale explantatie culturen gekleurd met Myf-5 naar 0 14% () illustreren; 15 24% (+), 25 49% (+), 50 74% (++); 75 100% ( + + +) niveau van samenloop. Het aandeel van putten met elk niveau van uitgroei (op elke dag van scoren) werd vermenigvuldigd met een willekeurig getal (= 1; (+) = 2; + = 3; + + = 4 en + + + = 5) voor de vergelijking van gegevens tot een definitieve uitgroei waarde te geven. Ongeveer 85% van de wild-type (C57BL/10) primaire eSMSc vlek voor de skeletspieren cel marker Myf-5. Vergroting is 10. (F) Opgericht embryonale culturen hebben de morfologische kenmerken van volwassen SMSC, bipolaire cellen (kleine pijl) en sferische monomorfe cellen (grote pijl). (G) Identificatie van fragmenteren apoptotische kernen met behulp van DAPI kleuring. (HI) Hoge (~ 75%) van de transfectie van een GFP-expressie construct in sms-cellijnen met behulp van de geoptimaliseerde Lipofectamine 2000 transfectie methode. (I) Het tellen van het totale aantal cellen wordt geholpen door DAPI tegenkleuring. RNAi gebruik pSHAGshRNAigfp (JM) schaft de GFP expressie in de SMSC (zie (29) voor een voorbeeld van deze constructie gebruikt als controle). (J) Control (mock transfectie) met GFP expressie in een GFP SMSC-lijn. (K) DAPI controle . (L) shRNAiGfp 24 uur na transfectie. (M) DAPI controle voor shRNAiGfp getransfecteerde cellen in (L).

Figuur 4. Dystrofische, embryonale Myf5-positieve myoblast zijn hyperproliferatieve en gevoelig voor apoptose. (A) De uitgroei percentage van embryonale myoblasten van de spieren explantatie cultuur is toegenomen, zowel in mdx mutanten van E11.5 en cav-3 (-/-) mutanten op E15.5 en E17.5 in vergelijking met WT explantaten gekweekt in parallel. (B) Een Myf5-immunostained explant. (C) hyperproliferatie van embryonale myoblasten in mdx mutanten van E11.5 en cav-3 (-/-) mutanten uit E15.5, zoals bepaald door Ki67-positieve immunoreactiviteit (D). (E) Verhoogde apoptose van E11.5 in mdx embryo's en van E15.5 in cav-3 (-/-) embryo's, zoals blijkt uit DAPI kleuring (F), de pijl in F wijst naar een apoptotische cel. * P <0,05 in vergelijking met WT, ** p <0,01 in vergelijking met WT; * p <0,05 bij het ​​vergelijken van MDX met CAV-3 (-/-) (G, H) E15.5 primaire gekweekte WT embryonale myoblasten met Myf5 vlekken. (G) en een tweede antilichaam controle (H). (I) De uitgroei percentage van E11.5 WT explanten toegenomen (* p <0,05) in E11.5 mdx explantatie-geconditioneerd medium (CM), maar niet in cav-3 (-/-) of WT CM. Foutbalken geven sd Dit cijfer wordt gereproduceerd onder auteurs auteursrecht en werd voor het eerst uitgegeven door de Vennootschap van de biologen in Merrick et al.., 2009.

6. Opmerkingen: kritische stappen en eventuele wijzigingen

1. Toen ontdooide cellen hebben aangesloten bij zeer lage celdichtheid is het verstandig om alleen te vervangen de helft van het medium om cultuur crash te voorkomen.
2. SMSC geïsoleerd van dystrofische spieren zijn vatbaar voor apoptose en moet behandeld worden met bijzondere zorg. Dystrofische SMSC (zoals de DFD-13 cellijn, die van skeletspieren opgericht verkregen uit 5-week-oude dystrofische (MDX) muizen) moeten worden gekweekt bij hogere celdichtheden dan gebruikelijk voor myoblasten. Dergelijke apoptose-gevoelige cellijnen zijn ook gecryopreserveerd bij hogere dichtheden (zie paragrafen 1.1 en 1.2) (19).
3. Een alternatieve methode voor het verwijderen van cellen uit een monolaag maakt gebruik van dispase, die een zachtere methode van de cel dissociatie biedt, met het voordeel dat het kan worden uitgevoerd in de aanwezigheid van FCS en calcium (beide aanwezig in DF10). Dispase kan dus worden gebruikt om de subcultuur en uit te breiden primaire skeletspieren Explantatie culturen en earlystage SMSC klonen (zie hoofdstukken 2 en 3).
4. Voor grotere flessen de hoeveelheid trypsine / EDTA gebruikt, moet worden opgeschaald als volgt uit: 75 mm ² fles (3 ml trypsine) en 175 mm ² kolf (5 ml trypsine). Op dezelfde manier te verlagen voor kleinere oppervlaktes van de hoeveelheid trypsine gebruikt (zie tabel 1).
5. Als alternatief, dissociatie kan worden gecontroleerd met behulp van een omgekeerde microscoop, wordt deze aanbevolen voor beginners.
6. Cryopreservatie van cellijnen wordt meestal uitgevoerd met behulp van een confluente groot (175 mm ²⁾ plastic schip. Tussen 7 en 9 cryovials kunnen worden verkregen bij een dergelijk groot schip, afhankelijk van het voortbestaan ​​profiel van de cellijn worden ingevroren. Primaire culturen en nieuw opgerichte cellijnen zijn vaak erg ongevoelig te bevriezen tot vaststelling van procedures. Het verbeteren van herstel en het succes van bevriezing dergelijke cellen twee benaderingen kunnen worden gebruikt (apart of in combinatie). (A) De FCS inhoud van de bevriezing beneden mengsel kan worden verhoogd van 10% (tot een maximum van 50%). (B) De bevriezing down proces kan worden vertraagd door het plaatsen van cryovials in de dampfase van de N2 gedurende 12-24 uur vóór de overdracht van flesjes naar de vloeibare fase.
7. Een handige manier om stevige bevestiging van de haemacytometer dekglaasje te controleren is om te zoeken naar Newton Ringen (regenboog reflecties in het glas) op het dekglaasje of als alternatief, om de haemacytometer houdt zijn kop naar beneden over een open hand.
8. Een variatie van de explantatie methode kan worden gebruikt voor de korte termijn culturen voor gebruik in de immunohistochemie, proliferatie en apoptose assays. Gemicrodissecteerde explantaten worden geplaatst op glas met 8-well kamer dia's. Een alternatieve methode is tot 9 mm gebruiken ^twee dekglaasjes geplaatst in 24-well platen. In beide gevallen twee explantaten worden overgebracht naar elk putje in 150 pi DF20 medium. Als alternatief kunnen primaire culturen worden door de subcultuur dispase methode en uitgeplaat op dekglaasjes geplaatst in 24-well platen of direct in 8-well kamer dia's.
9. Voor de kwantitatieve analyse van de uitgroei tarieven een minimum van 60 putjes die een explantatie per goed worden vastgesteld, per spier / muis stam. Om de groei parameters vast te stellen voor een stam ten minste drie afzonderlijke dieren moeten worden gebruikt. Platen en individuele putten worden niet gevoed, terwijl uitgroei wordt gescoord.
10. Voor het klonen van gevestigde SMSC-lijnen is het voldoende om de cultuur enkelvoudige cellen in een 1:1 mix van geconditioneerde medium en DF10 medium. Voor primaire explantaten is het noodzakelijk om het serum gehalte van het kweekmedium te verhogen tot 20%.
11. Colchicine is zeer giftig en een bekende kankerverwekkende stof en moeten worden behandeld met de juiste zorg. Dubbele handschoenen en werken in de beslotenheid van een aangewezen lade is van essentieel belang. Alle disposables (dat wil zeggen Gilsontips) worden geplaatst in een bekerglas van bleekwater (5% natriumhypochloriet) 's nachts voor het afvoeren van grote hoeveelheden water de vol-vleugel dag.
12. We gebruiken momenteel primaire antilichamen die specifiek zijn voor Ki67 en Myf-5 elk op 1 / 1, 000 verdunning. De optimale verdunning voor de primaire antilichamen moet empirisch worden vastgesteld voor elk antilichaam te gebruiken en ideaal ook voor de verschillende charges van hetzelfde antilichaam, zelfs wanneer het verkregen uit dezelfde bron.
13. Kamer dia's kunnen ook worden gebruikt voor deze test. Alvorens cellen in 4% PFA, wordt het kweekmedium verwijderd en cellen tweemaal gewassen met 37 ◦ C steriel PBS. De goed kamers, zijn pakking en lijm verwijderd en de glazen dia's geplaatst in een 50 ml glazen Coplin pot met vers bereide 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur, die vervolgens zachtjes op een Gyro-Rocker R_ shaker geschud gedurende 25 minuten. Dia's worden vervolgens tweemaal gewassen in PBS (kamertemperatuur) en ofwel direct gebruikt of opgeslagen in PBS bij 4 ◦ C (korte termijn; 1-2 weken) voor immunohistochemische (IHC) analyse.
14. Als er meer uitgebreide myotube formatie is vereiste primaire skeletspiercellen kan worden gedifferentieerd voor maximaal 8 dagen.

Discussion

Gemicrodissecteerde explant culturen kan worden gebruikt om betrouwbaar en reproduceerbaar isoleren celpopulaties met een zeer hoog aandeel (~ 85%) van de proliferatieve Myf-5 positieve skeletspieren stamcellen (SMSC). Onder het streng gecontroleerde kweekomstandigheden hier beschreven primaire explantatie culturen kan worden gebruikt om de groei gedrag van genetisch gemuteerde muis SMSC karakteriseren en kan worden gebruikt als een middel van het genereren van myotubes voor een gedetailleerde in vitro analyse van differentiatie processen. Zorgvuldig onderhoud en de manipulatie van deze culturen kunnen op lange termijn de cultuur en expansie. Met behulp van de beschreven methoden hier is het ook mogelijk af te leiden klonale skeletspieren stamcellijnen uit explantatie culturen door middel van eencellige verdunning. Om de proliferatie van enkele, geïsoleerde cellen tijdens het klonen procedure, "geconditioneerd medium" wordt gebruikt om de normale eisen van deze cellen voor high-density cultuur na te bootsen te bereiken. De methode is toepasbaar (met aanpassing) naar embryonale, volwassen en oud-volwassen weefsels en in aanvulling op de muis kan worden gebruikt om cellen van de skeletspieren van andere soorten waaronder de mens (Rao en Smith, niet gepubliceerd), kippenembryo en vis te isoleren ( zalm) ^24. Klonaal afgeleid SMSC kan worden geanalyseerd in vivo door intramusculaire transplantatie en onder deze omstandigheden geïnjecteerd SMSC zal combineren met gastheer myotubes om hybride spiervezels vormen. Intramusculair ingespoten SMSC vormen geen tumoren en zijn gevonden in gastheer spieren in de satelliet cel positie meer dan een jaar na de injectie, wat suggereert dat zij onderworpen zijn aan endogene controle door de satelliet stamcellen niche.These cellen kunnen opnieuw worden geïsoleerd van geïnjecteerde gastheren als proliferatieve SMSC meer dan 12 maanden na de gastheer injectie ^19.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 1:1 mix	Sigma-Aldrich		Liquid medium: (Dulbecco’s Modified Eagles’s medium and Ham’s F12 medium, 1:1 v/v)
100× Glutamine (200mM)	Sigma-Aldrich		Diluted in medium to a 1× concentration of 2 mM (Glutamine HYBRI-MAX R)
Fetal calf serum (FCS)	From a number of different companies		Batch tested on primary cultures and skeletal muscle cell lines. 10-20% supplement to liquid media
Heraeus Labofuge 300	Heraeus Instruments		Lab centrifuge capable of reaching 1,000 rpm
15 ml Falcon centrifuge tubes	Fisher Scientific		Must fit lab centrifuge
Tissue culture plasticware (25, 75 or 175 mm2 tissue culture vessels; 96-well tissue culture plates. 60 mm Petri dishes).	Nalge Nunc international
Humidified CO2 incubator (Heraeus)	Heraeus Instruments		Ours is copper lined, recommended for reducing contamination
Sterile hood with laminar air flow (Heraeus)	Heraeus Instruments		Ours is a Class II hood – suitable for use with Human tissues
Water Bath	Grant Equipment		Maintained always at 37°C
Inverted microscope	Leica Microsystems
70% Ethanol			For sterilization (animals, dissection instruments) and swabbing benches, hood, etc.
Calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich		Cell culture-tested PBS (Dulbecco’s formula) is purchased as a ready-mixed powder or in tablet form and made up with doubledistilled water before sterilization by autoclave. PBS consists of 2.68 mM potassium chloride (KCl); 1.47 mM potassium phosphate monobasic (KH2PO4); 0.137 M sodium chloride (NaCl); and 8.1 mM sodium phosphatedibasic (Na2HPO4). PBS can be prepared from scratch as follows: 200 mg KCl, 200 mg KH2PO4, 8 g NaCl and 1.15 g Na2HPO4/l of double-distilled water followed bysterilization by autoclave.
CryoTube vials	Nalge Nunc international
A Neubauer haematocytometer and coverslips	Fisher Scientific		For estimating cell counting
Hand counter	Fisher Scientific
Dissection microscope, Zeiss Stemi 1000	Carl Zeiss, Inc.		For preparation of explants
Small sterile hood
Sterile dissection instruments (including Jeweler’s forceps)			Sterilised by autoclave
Sterile plastic collecting vessels (7 ml bijou tubes or 20ml universals)	Nalge Nunc international
Warm PECM	Sigma-Aldrich		Made up in the sterile hood and warmed to 37°C in the tissue culture waterbath. DMEM:F-12 supplemented with 20% FCS, 1% glutamine and + 1% penicillin & streptomycin solution
Dispase (50 μg/ml, equivalent to 6 units/mg)	Available from MP Biomedicals, UK
10 μg/ml 4_,6 Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI).	Sigma-Aldrich		For microscopic visualization of apoptosis and mitosis
Vectashield fluorescent mounting fluid	Vector Laboratories
Fluorescent upright microscope with ultraviolet filter (we use a Nikon Eclipse E600)	Nikon Instruments
Digital camera and imaging software (we use a Nikon Coolpix 995 camera; A Nikon D3 camera	Nikon Instruments
OpenLab4.0a software	PerkinElmer, Inc.
Photoshop CS4	Adobe