Dechorionation эмбрионов оризии и клеточной трансплантации для генерации химерами

Summary

Из-за жестких и мягких хориона эмбрионов, манипуляции с эмбрионами оризии более сложный, чем в данио. Это видео показывает, шаг за шагом процедуры, как манипулировать оризии эмбрионов, в том числе dechorionation, монтаж в агарозном для работы с изображениями и клеточной трансплантации для производства химеры. Эти процедуры необходимо использовать оризии и данио в лаборатории, чтобы в полной мере использовать свои дополнительные возможности для генетической вскрытия позвоночных функции генома.

Abstract

Оризии небольшой откладки яиц пресноводных рыб, что позволяет как генетические, так и эмбриологических анализы и является одним из трех позвоночных организмов модель, в которой генома фенотипа мутанта управляемых экранов проводились ^1. Дивергенция функциональных перекрытия связанных генов между оризии и данио позволяет идентифицировать новые фенотипы, которые идентифицированы в один вид ^2, таким образом оризии и данио являются взаимодополняющими для генетических вскрытия позвоночных функции генома. Манипуляция эмбрионов оризии, таких как dechorionation, монтаж эмбрионы для создания образов и трансплантации клеток, являются ключевыми процедур для работы на обоих оризии и данио в лаборатории. Клеточная трансплантация рассматривает ячейки автономии мутаций оризии. Химеры генерируются путем пересадки меченых клеток-доноров эмбрионов в немеченого эмбрионов получателя. Донорские клетки могут быть пересажены в конкретных областях получателя эмбрионов на основе карты судьбы ^3, так что клоны из трансплантированных клеток могут быть интегрированы в ткань интересов в процессе разработки. Из-за жестких и мягких хориона эмбрионов, манипуляции с эмбрионами оризии более сложный, чем в данио. В этом видео мы покажем, детальные процедуры для манипулирования оризии эмбрионов.

Protocol

1. Развитие эмбриона

1. Когда они проложены, яйца сгруппированы из-за привязанности нитей на хориона. Чтобы позволить эмбрионы развиваются нормально, необходимо, чтобы отдельные яйца. Клубок и сократить вложения нити, удерживая привязанности нитей с двумя щипцами.
2. После unclustering, яйца отделяют от кала и водорослей и переданы на свежую среду эмбриона на максимальной плотностью 40 яиц на чашку Петри 6 см.
3. Оризии эмбрионов развиваться несколько медленнее, чем данио при 27 ° C. Сроки вылупления отличается между двумя видами; оризии эмбрионы вылупляются из хориона 7 дней и сразу начинают плавать и есть, в то время как данио эмбрионов люк в 2-х дней, но начинают плавать и питаться через 5-6 дней. Развитие оризии поставлен по постановке ⁴ Iwamatsu в.
4. Развитие эмбрионов оризии можно удобно регулировать экспериментальных планов, выбрав соответствующую температуру. Развитие эмбриона оризии может быть остановлена ​​при 4 ° С в начале развития. После стадии 24, когда начинается сердцебиение, развитие может быть замедлено использованием минимальной температуре 18 ° C.
5. Сроки появления органов / тканей немного отличается в оризии по сравнению с данио рерио, то есть в сомитогенеза оризии происходит после начала развития мозга, тогда как в somitegenesis данио предшествует развитие мозга.

2. Удаление хориона

Хориона из оризии состоит из двух защитных слоев с жесткого внутреннего слоя и мягкой внешней поверхности. Таким образом, двухступенчатая протеазы лечения использованием проназы и штриховка фермент необходим для удаления этого хориона.

После dechorionated, эмбрионы должны храниться в 1X BSS. Полу-стерильных условиях будет способствовать успешной культуры dechorionated эмбрионов, особенно при длительном наблюдении не требуется. К ним относится использование стерильных растворов (например, стерилизованные 1X BSS с антибиотиками) и инструменты стерилизуются 70% этанола с последующей промывкой с 1X BSS.

Как dechorionated эмбрионов оризии мягче и более хрупкие, чем dechorionated эмбрионов данио рерио, дополнительные забота должна быть взята, чтобы гарантировать, что они не связываются с воздуха или пузырьки в пипетку, так как это приведет к немедленному краху. Чтобы обеспечить минимальные повреждения эмбрионов, широким ртом тепла полированного стекла с пипеткой пипетки насос должен использоваться для передачи эмбрионов и волосы цикл должен быть использован ориентироваться эмбрионов для наблюдения. Номера для приверженца чашки Петри должно быть использовано для предотвращения эмбрионов от крепления к поверхности.

1. До dechorionation следует проверить, что яйца были достаточно разделены и очищенных.
2. Так как оба проназы и штриховка ферментов протеиназ, они должны быть на льду и минимизировать воздействие эмбрионов этих ферментов.
3. Передача яйца наждачной бумагой (P2000 зернистостью, водонепроницаемый), размещенные в крышке 9 см чашке Петри. Удалите излишки среде, но обеспечить достаточный объем остается, как предотвратить высыхание эмбрионов.
4. Аккуратно ролл эмбрионов около 45-60 секунд, чтобы удалить некоторые из внешней поверхности волос и слегка оценка поверхности хориона (рис. 1). Трансфер эмбрионов к оригинальному чашку Петри и исследовать.
   
   При прокатке эмбрионов на наждачную бумагу использовать указательный палец, применяя минимальное давление и сохраняя палец параллельно поверхности наждачной бумагой. Не ролл более 5-7 эмбрионов одновременно. Эта мера предосторожности позволит свести к минимуму риск дробления эмбрионов под друг друга.
   
   
5. Замените яйцо среды в блюдо с 20mg/ml проназы и инкубировать эмбрионов в течение 40-60 минут при 27 ° C.
   
   Обеспечить эмбрионов достаточной степени охвачены проназы и крышки присутствует на блюдо. Неиспользованные проназы должны храниться на льду во время этого шага, чтобы минимизировать самостоятельно пищеварение и могут быть повторно использованы, пока активность теряется (примерно 1-2 недель).
   
   
6. Восстановление проназы для повторного использования и мытья эмбрионов 5X в зародыше среда для удаления следов проназы как это инактивирует фермент штриховки будет добавлен.
7. Удалить среда эмбриона и эмбрионов с крышкой вылупления фермент, обеспечивающий эмбрионов участия в качестве монослоя в блюдо.
   
   Если яйца сидеть на верхней части друг с другом в блюдо, тех, кто внизу будет раздавлен, как хорион растворяется. Храните неиспользованную фермента вылупления на льду.
   
   
8. Инкубируйте эмбрионов при 27 ° С и через 15 минут периодически проверять ход штриховки при использовании стереомикроскопа.
   
   Это будет видно, что число лунного кратера подобные дыры начинают появляться в внутренний слой хориона, который вскоре после этого растворяется оставив мягкий наружный слой хориона легко снимается manually. Весь процесс вылупления может занять 15-60 минут.
   
   
9. Как только эмбрионы выйти из хориона, трансфер эмбрионов чашке Петри содержащие 1X BSS.
   
   Обеспечить не передавать штриховкой фермента 1X BSS, прикоснувшись кончиком пипетки на поверхность BSS позволяет эмбрионов, чтобы мягко выкатить.
   
   
10. После того как все эмбрионы переносятся из инкубационных фермента, сделать окончательный перевод на другую свежие блюда 1X BSS.
    
    Это гарантирует, эмбрионы не подвергаются какой-либо остатков фермента вылупления, так как это приведет к повреждению подвергаются эмбрионы. Как-то в этом последнем блюдо любого эмбрионов до сих пор обладающих внешний слой хориона можно вручную освобожденных использованием стерилизованных микро-щипцы под стереомикроскопа.
    
    Если эмбрионы должны быть разработаны следующие dechorionation, пенициллин / стрептомицин должны быть добавлены к BSS, чтобы предотвратить рост бактерий.
    
    

Рисунок 1. Сравнение проката и развернул эмбрионов во время dechorionation. Посмотрите, как прокат эмбрионов в B панели отсутствие волос увидеть на развернул эмбрионов в панели А.

3. Монтаж dechorionated эмбрионов

Агарозном вложение полезно для более длинных промежутков изображения (например, покадровой съемки) для живых эмбрионов, а также для детальных наблюдений фиксированных эмбрионов. Во время гаструляции и раннего органогенеза (стадия 14 до стадии 28), оризии эмбрионов выставку волны ритмических сократительных движений по всему перидермы, ткани слой охватывает как развитие эмбриона и желточного ^5. Эмбрионы относятся с 3,5 мм 1-гептанола остановить сократительные движения ^6.

Чтобы остановить движение эмбрионов после стадии 28 (64hpf), эмбрионы анестезии, добавляя каплями Tricaine мезилат (TMS) перед вложением. TMS также добавляется в агарозном (добавить лишь минимальное количество, эта доза должна быть оптимизирована, примерно в 1:25 разведение).

1. Оттепель небольшим количеством 3% низкая температура гелеобразования агарозы (в 1X BSS) при нагревании до 37 ° С и поддерживают при этой температуре.
2. Следующие шаги должны быть проведены быстро, чтобы агарозном не укрепить, прежде чем ориентировочно эмбриона. Используя широкий рот стеклянную пипетку передачи достаточно расплавленной агарозы, чтобы заполнить крышку депрессии трубки Эппендорф.
3. Передача один dechorionated эмбриона шапка депрессии минимизации переноса BSS с эмбрионом. Сразу же поглощение агарозы и эмбриона от депрессии крышку и передачи культуры камеры чашке Петри.
   
   3,5 см чашку Петри с оконного стекла на дне используется. Для визуализации с использованием инвертированного микроскопа, эмбрионы ориентированы вниз тело и помещается рядом с покровного стекла. Для визуализации с использованием прямой микроскоп, толщина агарозном сведена к минимуму.
   
   
4. Передача 3,5 см в чашке Петри диаметром 14 см чашку Петри содержащие льда и воды (воды заполнен до примерно 1 / 3 общей глубиной большое блюдо). Хотя проведение камеру вниз твердо на дне чашки Петри 14 см, используйте цикл волос, чтобы мягко ориентировать эмбриона по желанию в расплавленной агарозы и удерживать эмбрион, пока агарозном затвердевает, осторожно поднимая и опуская меньше блюдо в исходное положение в ледяной воде.

4. Клеточная трансплантация эмбрионов в оризии

Целью этой процедуры является ли ген ставки действует клеточной автономно (в клетку) или без клеточной автономно (между ячейками).

Донорские клетки могут быть помечены красителем трассирующими, таких как родамин-декстран до трансплантации (как указано в "микроинъекции эмбрионы оризии 'сопровождающих протокол Юпитера) или трансгенных штамма с выражением GFP может быть использована, позволяя трансплантации оценки. Комбинация обоих методов маркировки часто бывает полезно для преодоления авто-флуоресценции с которыми можно столкнуться. Для покадровой исследования после трансплантации, GFP выражение особенно полезным.

Используйте широкий рот стеклянную пипетку с пипеткой насос всей этой процедуры и стерилизовать все инструменты (в том числе слайды) заранее с 70% этанола с последующим тщательным промыванием стерильной 1X BSS. Получатель эмбрионов, как правило, разработаны по сцене 12, как это позволяет дискриминацию брюшной и спинной полюсов при проведении трансплантации.

1. Начать dechorionating эмбрионов за 1,5 часа до трансплантации и установки аппарата инъекции во время инкубации фермента.
2. Место слайд полости микроскопом в диаметре 9 см блюдо Петри. Добавить небольшое количество 3% метилцеллюлозы в центр лунки, используя стерильный наконечник пипетки и тонким слоем.
3. Сухой метилцеллюлозы в течение примерно 1-2 минут.
4. Добавить 350μl стерильных 1X BSS для заполнения слайд депрессии.
5. Передача одного эмбриона доноров и до четырех эмбрионов получателя слайд с помощью стеклянной пипетки.
6. Ориентироваться эмбрионов использованием волос петли, так бластодерма эмбриона вверх.
   
   Эмбрионы могут быть прислонившись друг с другом для дальнейшего повышения устойчивости.
   
   
7. Аккуратно вставьте микро-иглы в бластодерма доноров и медленно поглощение 10-20 клеток.
8. Осторожно введите иглу в требуемой области получателя бластодерма эмбриона и изгнать клетки медленно. Особую осторожность следует соблюдать осторожность при вставке ячеек на получателя бластодерма, чтобы не нарушить клеточных желточного мешка границы, поскольку это может привести к смерти эмбриона.
9. Налейте стерилизовать 1X BSS в чашке Петри.
   
   Аккуратно влить BSS в блюдо как можно ближе к стороне блюда, как можно так, чтобы не нарушить эмбрионов. Никогда не лейте BSS непосредственно на эмбрионах и добавить достаточное BSS, что слайд и эмбрионов погружены.
   
   
10. Добавить 100 мкл пенициллина / стрептомицина на блюдо и накройте. Тщательно передачи блюдо 27 ° C инкубатор, чтобы нормально развиваться.
11. Эмбрионы могут периодически наблюдается как хотелось бы. При использовании трансплантации проводить получить-функции и / или экспериментов фенотип спасения, некоторые морфологические изменения, наблюдаемые может быть связано с последствиями трансплантации. Таким образом несколько трансплантаций являются необходимыми. Через 2-3 дней, меланофоры должны присутствовать на желточный мешок, голова, глаза и туловища. Если присутствует на пересаженных эмбрионов затем успешная химера имеет, скорее всего, были произведены (рис. 3).

При необходимости, генотип донора эмбриона (ов) путем перечисления на ПЦР трубки (ы) с 25 мкл из 20mg/ml протеиназы К. Инкубировать при 55 ° С в течение 4 часов, затем 10 минут при 94 ° С и проводить ПЦР.

5. Представитель результаты

Рисунок 2. Пример положение агарозном встраиваемый эмбриона. Передняя показан справа и зрения спинной. Группа B: эндотелиальные клетки можно видеть по обе стороны от тела эмбриона и помечены использованием GFP управляется промоутер FLI.

Рисунок 3. Изображения после трансплантации эмбрионов. Изображение показывает донора и реципиента эмбрионов сразу после трансплантации. Донора эмбриона показано на рисунке справа с совершенно красным бластодерма (стрелка). Получатель эмбриона показано на рисунке слева и легко идентифицировать по небольшой массы красного пересаженные клетки видны в бластодерма (стрелки). Изображение В показывает два эмбриона получателя около 7 часов после трансплантации (инкубировали при 27 ° С). Обратите внимание, что пересаженные клетки мигрировали от места трансплантации и в настоящее время рассредоточены по бластодерма (стрелки). Изображение С показывает получателю эмбриона на st.29 (примерно 74hpf). Обратите внимание, пигментации глаз и наличие меланофоры в багажник и головного мозга (стрелки). Родамин-меченых клеток можно видеть, что колонизации многие из эмбриональных структур с указанием успешного производства химера.

Discussion

В этом видео мы показали, как dechorionate и проводить ячейки transplanataion на эмбрионах оризии. Это мощный метод для получения химерных эмбрионов для исследования генов / белков функции в процессе развития, а также для выяснения автономии генов / белков в вопросе. Оризии являются полезной модели системы позвоночных на эту технику из-за хорошо организованной судьба карт и их прозрачность кредитования хорошо их в естественных условиях в режиме реального времени изображения. Трансплантация может быть объединен с микроинъекции (как указано в "микроинъекции оризии эмбрионов сопровождающих протокол Юпитера), так что поведение пересаженных клеток может быть легко наблюдается.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.