Summary
하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오는 chimeras의 생산을위한 이미징 및 세포 이식에 대한 아가로 오스의 장착 dechorionation 포함한 medaka의 배아를 조작하는 방법에 대한 단계별 절차를 나타냅니다. 이러한 절차는 척추 게놈 기능의 유전자 해부 위해 상호 보완적인 기능을 최대한 활용하기 위해 실험실에서 medaka와 zebrafish를 사용하는 필수적입니다.
Abstract
Medaka는 유전자와 embryological 모두 분석이 가능하고 게놈 차원의 표현형 기반 돌연변이 화면이 1을 실시했다하는 세 개의 척추 모델 생물 중 하나입니다 작은 달걀 - 누워있는 민물고기이다. medaka와 zebrafish 사이의 관련 유전자의 기능 중복의 발산 따라서 단일 종 2 medaka 및 zebrafish는 척추 게놈 기능의 유전자 해부에 대한 보완으로 식별할 아르 소설 phenotypes의 신분을 수 있습니다. 같은 dechorionation 같은 medaka의 배아, 이미징 및 세포 이식에 대한 설치 배아의 조작은 실험실에서 medaka와 zebrafish 모두에서 작동하는 주요 절차입니다. 세포 이식은 medaka의 돌연변이 세포 자율성을 검사합니다. Chimeras는 레이블이 지정되지 않은받는 사람 배아에 기증자의 배아에서 세포를 이식 라벨에 의해 생성됩니다. 기증자 세포는 이식 세포의 클론이 개발 중에 관심의 조직에 통합 될 수 있도록 운명지도 3을 기반으로받는 사람 배아의 특정 영역에 이식 수 있습니다. 하드 chorion 부드러운 배아, medaka의 배아의 조작으로 인해 더 zebrafish에 비해 참여합니다. 이 비디오에서는, 우리는 medaka의 배아를 조작하는 자세한 절차를 보여줍니다.
Protocol
1. 배아 개발
- 그들이 마련되면, 계란 때문에 chorion에 첨부 필라멘트의 클러스터입니다. 배아가 정상적으로 발전하게하기 위해서는 별도의 달걀이 필요합니다. 탱글 두 집게로 첨부 필라멘트를 개최하여 첨부 필라멘트를 잘라.
- unclustering 후, 계란은 대변과 조류에서 분리되고 6cm 페트리 접시 40 알을 최대 밀도에서 신선한 배아 매체로 전학 왔어.
- Medaka의 배아는 27 zebrafish보다 약간 느린 개발 ° C.를 부화의 타이밍은 두 종의 사이에 다른, medaka의 배아 7 일 이내에 chorion에서 부화 즉시 zebrafish의 배아가 2 일 부화 반면, 수영과 식사를 시작하지만, 5-6일에서 수영도하고 식사를 시작합니다. medaka의 개발은 이와 마쓰의 준비 4에 따라 개최됩니다.
- medaka의 배아의 발달은 편리 적절한 온도를 선택하여 실험 계획을 조정할 수 있습니다. medaka의 배아의 개발은 초기 개발 4 ° C에서 중지하실 수 있습니다. 스테이지 24 후 가슴이 뛰는가 시작될 때, 개발, 18의 최소 온도 ° C.를 사용하여 느려짐 수 있습니다
- zebrafish의 somitegenesis의 두뇌 개발을 앞에 반면 장기 / 조직의 외관의 타이밍은 zebrafish에 비해 medaka에 약간의 차이이며, medaka의 somitogenesis에서 즉 두뇌 개발의 발병 후 발생합니다.
2. chorion 제거
medaka의 chorion은 하드 내부 레이어와 부드러운 외부 표면을 가진 두 개의 보호 층으로 구성되어 있습니다. 그러므로, pronase 및 부화 효소를 채용 두 단계 테아제 치료는이 chorion을 제거하는 것이 필요합니다.
일단 dechorionated, 배아는 1X BSS에 보관해야합니다. 세미 무균 조건은 더 이상 관찰 기간이 필요 특히, dechorionated 태아의 성공적인 문화를 강화합니다. 이들은 1X BSS와 rinsing 다음 70 % 에탄올로 소독 살균 솔루션 (예 : 항생제와 1X BSS를 소독) 및 도구를 사용하여 포함됩니다.
dechorionated medaka의 배아는 dechorionated zebrafish의 배아보다 부드럽고보다되기로 추가주의가이 즉각적인 붕괴의 원인이되므로, 그들은 피펫에 공기 또는 거품 연락을하지 않도록하기 위해 이동해야합니다. 배아에 최소한의 피해를 보장하기 위해, 피펫 펌프와 입을 크게 벌리고 열 광택 유리 피펫는 전송 배아 사용해야하며 머리를 루프는 관찰을 위해 배아를 동쪽을 향하게하기 위해 활용해야합니다. 비 점착 성의 배양 접시는 표면에 붙이는 배아를 방지하기 위해 사용해야합니다.
- 이전 dechorionation에가 계란이 충분히 분리 및 청소 접속되었는지 확인한다.
- pronase 및 부화 효소가 모두 proteinases이기 때문에, 그들은 얼음에 보관 이러한 효소에 태아의 노출을 최소화해야합니다.
- 9cm 페트리 접시의 뚜껑에 배치 사포 (p2000 그릿 크기, 방수)으로 달걀을 전송합니다. 초과 매체를 제거하지만 배아의 건조 방지하는 등 충분한 볼륨이 남아 있는지 확인합니다.
- 부드럽게 외부 표면 머리카락의 일부를 제거하고 가볍게 chorion의 표면 (그림 1)을 점수를 45-60 초 동안 주변 배아를 롤. 원래는 배양 접시에 다시 배아를 전송하고 확인합니다.
사포에 롤링 배아는 최소한의 압력을 적용하고 손가락을 평행이 모래 종이의 표면에 유지, 집게손가락을 사용하면. 한번에 5-7 배아 이상 올리지 말아요. 이주의 서로 아래 배아를 분쇄의 위험을 최소화합니다. - 27 40-60분에 대한 20mg/ml pronase 및 부화의 배아와 함께 접시에 계란 매체를 교체 ° C.
확인 배아는 충분히 pronase이 적용하고 뚜껑은 요리에 존재하고 있습니다. 사용하지 않는 pronase는 자기 소화를 최소화하기 위해이 단계 동안 얼음에 보관되어야하며 활동 (약 1~2주) 손실까지 활용할 수 있습니다. - 재사용이 추가로 부화 효소를 inactivate하므로 pronase의 흔적을 제거하는 배아 매체 배 세척의 배아에 대한 pronase를 복구할 수 있습니다.
- 배아는 접시에 monolayer로 앉아 보장, 부화 효소와 배아 매체와 커버 배아를 제거합니다.
계란은 접시에 서로 위에 앉아 경우 chorion가 디졸브로, 하단에 해당 심하게 상처받을 것이다. 얼음 않는 부화 효소 보관하십시오. - 27 배아를 품어 ° C 15 분 후에 정기적으로 stereomicroscope를 사용하여 부화의 진행 상태를 확인합니다.
이것은 음력 분화구처럼 구멍의 숫자가 곧 쉽게 manuall를 제거 chorion의 부드러운 외부 계층이 떠난 다음 디졸브 chorion의 내부 계층으로 나타나기 시작 것을 보여줄 것입니다Y. 부화의 전체 과정은 15-60 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 마자 배아가 chorion에서 나와 같은 1X BSS를 포함 페트리 접시에 배아를 전송할 수 있습니다.
배아는 부드럽게 밖으로 롤 수 있도록 BSS의 표면에 피펫의 팁을 만져 1X BSS에 부화 효소를 전송하지 확인하십시오. - 모든 배아는 부화 효소에서 전송되면, 1X BSS의 다른 신선한 요리로 최종 전송합니다.
이것은이 노출된 배아를 손상되므로 태아가, 부화 효소의 잔존물에 노출되지 않습니다 보장합니다. 일단이 마지막 접시에 여전히 chorion의 바깥 레이어를 가진 어떤 태아는 stereomicroscope에 따라 소독을 마이크로 - 집게를 사용하여 수동으로 해방하실 수 있습니다.
배아는 다음 dechorionation을 개발해야하는 경우, 페니실린 / 스트렙토 마이신은 세균 성장을 방지하기 위해 BSS에 추가되어 있어야합니다.
그림 1. dechorionation 중 압연 및 unrolled 배아의 비교. 패널 B의 압연 배아는 패널 A에서 unrolled 배아에서 본 머리카락이 부족하는 방법 준수
3. 장착 dechorionated 배아
아가로 오스의 포함 사는 배아의 이미징의 긴 기간 (예 : 시간 저속 영상)뿐만 아니라 고정 배아에 대한 자세한 관찰에 유용합니다. gastrulation 및 초기 organogenesis (단계 28 단계 14) 동안 medaka의 배아는 periderm, 개발 배아와 노른자 5를 모두 다루는 조직 층에 걸쳐 리듬 수축성 운동의 물결을 나타냅니다. 배아는 수축성 움직임 6을 중지 3.5mM 1 heptanol로 취급됩니다.
무대 28 일 (64hpf) 이후 태아의 움직임을 중지하려면 배아는 포함하기 전에 Tricaine mesilate (TMS)의 방울을 추가하여 anaesthetized 있습니다. TMS도 (에만 최소한의 금액을 추가,이 복용량은 약 1시 25분 희석을 최적화할 필요) 아가로 오스에 추가됩니다.
- ° C이 온도에서 유지 37 가열 3 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스 (1X BSS)을 소량을 녹여.
- 다음 단계는 아가로 오스는 배아를 orientating 전에 응고하지 않도록 신속하게 진행해야합니다. Eppendorf 튜브의 뚜껑 우울증을 채우기 위해 입을 크게 벌리고 유리 피펫 전송 충분히 녹은 아가로 오스를 사용하여.
- 배아와 BSS으로 운반 최소화 캡 우울증 한 dechorionated 배아를 전송합니다. 즉시 이해 아가로 오스와 캡 우울증과 페트리 접시 문화 챔버로 전송에서 배아.
하단에 유리 창을 3.5cm 페트리 접시가 사용됩니다. 거꾸로 현미경을 사용하여 영상을 위해, 배아가 지향 신체 있는거야하고 덮개 유리에 가까운 위치. 똑바로 현미경을 사용하여 영상을위한, 아가로 오스의 두께가 최소화됩니다. - 얼음과 물을 (물 큰 접시의 약 3분의 1 총 깊이 가득)이 포함된 14cm 직경 페트리 접시에 3.5cm 페트리 접시를 전송합니다. 단단히 14cm 페트리 접시의 바닥에 아래 챔버를 개최하고 수시로 찾아내는 '용융 아가로 오스의 원하는대로 부드럽게 배아를 동쪽을 향하게하는 헤어 루프를 사용하고 아가로 오스는 부드럽게 원래 위치로 작은 접시를 제기하고 낮추어 굳은 때까지 배아를 개최 얼음 냉수 인치
4. medaka의 배아에서 세포 이식
이 절차의 목적은 관심의 유전자가 세포 자율적으로 (셀 이내) 또는 비상 휴대 자율적를 (셀 사이) 행위 여부를 확인하는 것입니다.
기증자 세포는 이식 평가되기 전에 이식 이러한 rhodamine - dextran으로 추적 염료 (로 함께 조브 프로토콜 'Medaka의 배아들 중 Microinjection'에 명시된 바와 같이) 또는 활용 수 있습니다 GFP 발현과 유전자 변형 응력으로 표시 수 있습니다. 두 분류 기술의 조합은 종종 발생 수있는 자동 형광을 극복하는 데 유용합니다. 이식에 따라 시간 저속 연구, GFP의 표현이 특히 유용합니다.
이 절차를 통해 피펫 펌프와 입을 크게 벌리고 유리 피펫을 사용하여 70 % EtOH로 사전에 모든 도구 (슬라이드 포함) 소독은 살균 1X BSS와 rinsing 철저한 다음. 이 이식을 수행 복부와 지느러미 기둥의 차별을 허용으로받는 배아는 일반적으로 주위 단계 12 개발하고 있습니다.
- 이전 효소 incubations 동안 이식 및 설치 분사 장치로 태아에게 1.5 시간을 dechorionating 하십시요.
- 9cm 직경 페트리 접시에 캐비티 현미경 슬라이드를 놓습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 캐비티 슬라이드의 중심에 3 % 메틸 셀룰로오스의 작은 금액을 추가하고 얇게 퍼졌다.
- 약 1~2분에 대한 건조 메틸 셀룰로오스.
- 슬라이드 우울증을 채우기 위해 무균 1X BSS의 350μl를 추가합니다.
- 유리 피펫을 사용하여 슬라이드 한 기증자의 배아와 최대 4 개의받는 사람 배아를 전송합니다.
- 배아의 배반엽가 위쪽에 직면하므로 머리 루프를 사용하여 동쪽을 향하게 배아.
배아 더욱 증가 안정성 서로 leant 수 있습니다. - 부드럽게 기증자 배반엽 천천히 이해 10-20 세포로 마이크로 바늘을 삽입합니다.
- 부드럽게받는 배아 배반엽 요구하는 영역에 바늘을 삽입하고 천천히 세포를 추방. 이 배아의 죽음을 초래하므로받는 사람 배반엽에 전지를 삽입하는만큼 휴대 난황의 경계를 중단하지 않을 경우 큰주의하여야한다.
- 페트리 접시에 소독 1X BSS 하거라.
조심스럽게만큼 배아를 방해하지 않도록 가능한 한 접시의 측면에 가까운 그릇에 BSS를 부어. 태아에 직접 BSS를 부어도하고 슬라이드와 배아가 포장되어있는 것으로 이러한 충분한 BSS를 추가 마십시오. - 접시와 커버하기 위해 페니실린 / 스트렙토 마이신의 100μl를 추가합니다. 조심스럽게 정상적인 개발을 허용하는 27 ° C 배양기로 요리를 전송할 수 있습니다.
- 배아는 주기적으로 원하는대로 볼 수 있습니다. 이득의 기능 및 / 또는 표현형 구조 실험을 수행하는 이식을 사용하는 경우, 관찰 일부 형태학의 변화가 이식의 효과에 의한 것입니다. 따라서 여러 transplantations가 필요합니다. 2~3일 후 melanophores는 난황, 머리, 눈, 그리고 트렁크에 존재해야합니다. 이식 배아에 존재 그렇다면 성공 가능성이 가장 높은 키메라 생산하지 않은 경우 (그림 3).
경우에는 55 ° 94시 10 분 다음 4 시간 동안은 C ° C와 PCR를 수행합니다. 20mg/ml proteinase K.에서 품어의 25μl를 포함하는 PCR 튜브 (S)로 전송하여 필요한 유전자형 기증자의 배아 (S)
5. 대표 결과
그림 2. 아가로 오스 - 임베디드 배아의 예제 위치. 앞쪽에는 오른쪽에 표시되며보기 지느러미입니다. 패널 B : 내피 세포는 배아 몸 양쪽에 볼 수 있으며 수 있는데 프로 모터에 의해 구동 GFP를 사용하여 표시됩니다.
그림 3. 후의 이식 배아의 이미지. 이미지가 바로 사후 이식 기증자와받는 배아를 보여줍니다. 기증자의 배아는 완전 빨간색 배반엽 (화살표)를 오른쪽에 표시됩니다. 받는 사람 배아는 왼쪽에 표시되며 쉽게 배반엽 (화살촉)에서 볼 수 붉은 이식 세포의 작은 질량에 의해 식별됩니다. 이미지 B 두 개의받는 사람 배아를 보여줍니다 약 7시간 후 이식 (27 ° C에서 incubated). 이식 세포 이식의 사이트에서 마이 그 레이션하고 이제 배반엽 (화살표)에 걸쳐 분산 아르 확인할 수 있습니다. 이미지 C는 st.29 (약 74hpf)에서받는 사람의 배아를 보여줍니다. 트렁크 및 뇌 영역 (화살표)에서 눈과 melanophores의 존재에 착색되어 있습니다. rhodamine - 라벨이 전지는 키메라의 성공적인 생산을 나타내는 배아 구조의 많은 colonizing로 볼 수 있습니다.
Discussion
이 비디오에서는 dechorionate 및 medaka의 배아에서 세포 transplanataion을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이것은 개발하는 동안 유전자 / 단백질의 기능 연구뿐만 아니라 유전자 / 해당 단백질의 자율성을 elucidating위한 키메라 배아를 생산하는 강력한 기술입니다. Medaka는 생체내 실시간 영상에 잘에 잘 구축 운명을지도하고 투명 대출로 인해이 기술에 대한 유용한 척추 모델 시스템입니다. 이식은 이식 세포의 행동이 쉽게 관찰 할 수 있도록 microinjection (같이 함께 조브 프로토콜 'Medaka 배아들 중 Microinjection'에 명시된)와 함께하실 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 MRC에서 M. FS에 부여에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo medium | Reagent | Made in-house | N/A | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.) |
| Micro-dissecting forceps | Tools | 55 INOX A.DUMONT&FILS | N/A | Very sharp fine tips for removal of chorion. |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | N/A | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. |
| 3% methylcellulose | Reagent | Sigma | M 0512 | High viscosity for holding embryos in place during transplantation. |
| 1X BSS | Reagent | Made in-house | N/A | 20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use. |
| Penicillin-streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | Added to BSS when incubating dechorionated embryos. |
| Pronase | Reagent | Calbiochem | 53702 | For dechorionation. |
| Hatching enzyme | Reagent | Made in-house | N/A | For dechorionation. |
| Tricaine mesilate (TMS) | Reagent | Sigma | A-5040 | 400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water. |
| 3% ultra-low gelling temp. agarose | Reagent | Sigma | A-2576 | Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation. |
| Petri dish culture chamber | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 11-004-008 | Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation. |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige | N/A | Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation. |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10T | For making transplantation needles. |
| Flaming/Brown micropipette puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | For making transplantation needles. |
References
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- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).
- Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation. Development. 131, 2553-2563 (2004).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Zool Sci. 11, 825-839 (1994).
- Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo. J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. J Vis Exp. , (2009).
