Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Summary

בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא היתרונות של התכונות המשלימות שלהם לנתיחה הגנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

Abstract

Medaka הוא דג קטן ההטלה מים מתוקים המאפשר ניתוח הן גנטיות העוברית והיא אחת משלוש חוליות אורגניזמים מודל שבו הגנום כולו פנוטיפ מונחה מסכי מוטציה בוצעו ^1. החפיפה סטייה תפקודית של גנים הקשורים בין medaka ו דג הזברה מאפשר זיהוי של פנוטיפים רומן כי הם ניתנים לזיהוי ב זן יחיד ^2, ובכך medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. מניפולציה של עוברים medaka, כגון dechorionation, עוברים הרכבה עבור הדמיה השתלת תאים, הם הליכים מפתח לעבוד על שניהם medaka ו דג הזברה במעבדה. השתלת תאים בוחן אוטונומיה תא של מוטציות medaka. מפלצות נוצרות על ידי השתלת תאים מעוברים שכותרתו התורם לעוברי הנמען ללא תווית. תאים התורם ניתן להשתיל לאזורים מסוימים של עוברי הנמען מבוסס על גורל מפות ³ כך שיבוטים של התאים המושתלים יכולים להיות משולבים ברקמות של עניין במהלך הפיתוח. בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. בסרטון הזה, אנו מראים נהלים מפורטים לתפעל עוברים medaka.

Protocol

1. התפתחות העוברים

1. כאשר הם הניחו, ביצים מקובצים בגלל חוטים מצורף על סיסית. כדי לאפשר לפתח עוברים בדרך כלל, יש צורך להפריד ביצים. סבך החוטים וחותכים מצורף ידי החזקת חוטים התקשרות עם שני מלקחיים.
2. לאחר unclustering, ביצים מופרדות צואה ואצות והועברו בינוני העובר טרי בצפיפות מירבית של 40 ביצים לכל צלחת פטרי 6cm.
3. עוברים Medaka לפתח מעט איטי יותר מאשר דג הזברה ב 27 ° C. העיתוי של הבקיעה שונה בין שני המינים; עוברים medaka בוקעות מן סיסית 7 ימים ומיד מתחילים לשחות ולאכול, בעוד עוברי דג הזברה בוקעות 2 ימים אך מתחילים לשחות ולאכול 5-6 ימים. פיתוח medaka מבוים פי ⁴ הזמני של Iwamatsu.
4. הפיתוח של עוברים medaka ניתן להתאים בנוחות תוכניות ניסיוניות ידי בחירת הטמפרטורה המתאימה. פיתוח של עוברים medaka ניתן עצרה 4 ° C בהתפתחות המוקדמת. אחרי שלב 24 כאשר הלב פועם מתחיל, פיתוח יכול להיות האטה באמצעות טמפרטורת מינימום של 18 ° C.
5. עיתוי הופעתו של איברים / רקמות היא מעט שונה medaka לעומת דג הזברה, כלומר somitogenesis medaka מתרחשת לאחר תחילת התפתחות המוח ואילו somitegenesis דג הזברה מקדים להתפתחות המוח.

2. הסרת סיסית

סיסית של medaka מורכב משתי שכבות מגן בשכבה הפנימית קשה משטח רך החיצונית. לכן, טיפול שני שלבים פרוטאז העסקת pronase ואת האנזים הבקיעה יש צורך להסיר סיסית.

Dechorionated פעם, עוברים יש לשמור 1X BSS. חצי סטרילי תנאי ישפר את תרבות מוצלחת של העוברים dechorionated, במיוחד כאשר תקופות ארוכות יותר של התבוננות נדרשים. פתרונות אלה כוללים שימוש סטרילי (למשל עיקור 1X BSS עם אנטיביוטיקה) וכלים מעוקרים אתנול עם 70% ואחריו שטיפה 1X BSS.

כפי dechorionated עוברים medaka הם רך ושברירי יותר עוברי דג הזברה dechorionated, משנה זהירות יש לנקוט כדי להבטיח שהם לא פנה אוויר או בועות פיפטה, כמו זה יגרום קריסה מיידית. כדי להבטיח פגיעה מזערית עוברים, פעורת פה זכוכית מלוטשת עם משאבת חום פיפטה פיפטה יש להשתמש בעוברים העברת לולאה השיער צריך להיות מנוצל כדי להתמצא עוברים לצורך השגחה. Non-חסיד צלחות פטרי צריך לשמש כדי למנוע מן העוברים הצמדת משטחים.

1. לפני dechorionation זה יש לבדוק כי ביצים שהופרדו מספיק וניקה-up.
2. מאז הן pronase ואנזימים הבקיעה הם proteinases, הם צריכים להיות כל הזמן על הקרח לצמצם את החשיפה של עוברים אלה אנזימים.
3. העברת ביצים נייר זכוכית (p2000 בגודל חצץ, עמיד למים) להציב מכסה של צלחת פטרי 9cm. הסר בינוני עודף אלא להבטיח נפח מספיק נשאר כדי למנוע ייבוש של עוברים.
4. לגלגל בעדינות עוברים כ 45-60 שניות כדי להסיר כמה שערות המשטח החיצוני קלות ציון את פני השטח של סיסית (איור 1). העברת עוברים בחזרה צלחת פטרי המקורית ולבחון.
   
   כאשר עוברים מתגלגל על ​​נייר זכוכית להשתמש באצבע, הפעלת לחץ מינימלי ושמירה במקביל אצבע על פני השטח של נייר חול. אל רול יותר עוברים 5-7 בבת אחת. זהירות זה יהיה למזער את הסיכון של ריסוק עוברים מתחת לזה.
   
   
5. החלף בינוני ביצה בצלחת עם pronase 20mg/ml ועוברים דגירה של 40-60 דקות על 27 ° C.
   
   ודא עוברים מכוסים דיים על ידי pronase ואת מכסה קיים על המנה. Pronase שאינם בשימוש יש לשמור על הקרח במהלך שלב זה כדי למזער עצמית העיכול ניתן לעשות שימוש חוזר עד פעילות אבוד (כ 1-2 שבועות).
   
   
6. שחזור pronase לשימוש חוזר ועוברים לשטוף 5X במדיום העובר כדי להסיר עקבות של pronase כמו זה יהיה להשבית את האנזים הבקיעה להתווסף.
7. הסר בינוני העובר ועוברים לכסות עם האנזים הבקיעה, הבטחת עוברים לשבת כמו monolayer בצלחת.
   
   אם יש ביצים לשבת על גבי אחד לשני בצלחת, אלה שבתחתית יהיה מעוך כמו סיסית נמס. שמור אנזים הבקיעה בשימוש על הקרח.
   
   
8. לדגור העוברים על 27 מעלות צלזיוס, לאחר 15 דקות לבדוק מעת לעת את התקדמות הבקיעה באמצעות stereomicroscope.
   
   זה יהיה לראות כי מספר הירח מכתש כמו חורים מתחילים להופיע בשכבה הפנימית של סיסית, אשר בקרוב מתמוסס הבאה זה משאיר השכבה החיצונית הרכה של סיסית להסיר בקלות manuallי ' כל התהליך של הבקיעה עלול לקחת 15-60 דקות.
   
   
9. ברגע עוברי לצאת מן סיסית, העברת העוברים על צלחת פטרי המכילה 1X BSS.
   
   ודא שלא להעביר אנזים הבקיעה את BSS 1X ידי נגיעה קצה פיפטה על פני השטח של BSS המאפשר העוברים בעדינות לרדד.
   
   
10. ברגע שכל העוברים מועברים אנזים הבקיעה, לבצע העברה הסופי מאכל אחר טריים של 1X BSS.
    
    זה מבטיח עוברי לא נחשפים כל שאריות האנזים הבקיעה, כמו זה יהיה נזק עוברי חשוף. לאחר בצלחת זה סופי כל עוברי עדיין בעל השכבה החיצונית של סיסית יכול להיות משוחרר באופן ידני באמצעות עיקור מיקרו מלקחיים תחת stereomicroscope.
    
    אם עוברים צריך להיות מפותח dechorionation הבאים, פניצילין / סטרפטומיצין יש להוסיף את BSS כדי למנוע התפתחות חיידקים.
    
    

באיור 1. השוואה בין עוברים התגלגל פרשו במהלך dechorionation. שים לב כיצד עוברים התגלגל B פאנל העדר שערות לראות על עוברי פרש בלוח א

3. עוברים dechorionated הרכבה

הטבעה agarose שימושית עבור תקופות ארוכות יותר של הדמיה (למשל זמן לשגות הדמיה) עבור עוברים לחיות כמו גם תצפיות מפורטות של עוברים קבוע. במהלך gastrulation ו organogenesis מוקדם (שלב 14 שלב 28), עוברים medaka התערוכה גלים של תנועות התכווצות קצבית ברחבי periderm, שכבת רקמה המכסה גם את העובר המתפתח ואת חלמון ^5. עוברים מטופלים עם 3.5mm 1-heptanol להפסיק תנועות התכווצות ^6.

כדי לעצור את התנועה של העוברים לאחר שלב 28 (64hpf), עוברים הם מורדמים ידי הוספת טיפות Tricaine mesilate (TMS) לפני ההטבעה. TMS תתווסף גם agarose (רק להוסיף כמות מזערית, מינון זה צריך להיות מותאם, כ דילול 01:25).

1. הפשירי כמות קטנה של 3% נמוך הטמפרטורה gelling agarose (ב 1X BSS) על ידי חימום ל 37 ° C ולשמור על בטמפרטורה הזאת.
2. השלבים הבאים צריכים להתבצע במהירות על מנת להבטיח כי agarose לא לפני orientating לחזק את העובר. שימוש פעורת פה פיפטה זכוכית מותכת העברת agarose מספיק כדי למלא את המכסה של דיכאון צינור Eppendorf.
3. העברה חד העובר dechorionated לדיכאון את הכובע מזעור נושאת על BSS עם העובר. מיד ספיגת agarose ואת העובר מדיכאון את הפקק להעביר קאמרית תרבות צלחת פטרי.
   
   צלחת פטרי 3.5cm עם חלון זכוכית בתחתית משמש. עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, הם עוברים על הבטן הגוף חוקיים והניח קרוב זכוכית המכסה. עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ זקוף, עובי של agarose ממוזער.
   
   
4. מעבירים את צלחת פטרי 3.5cm לתוך צלחת 14cm קוטר פטרי המכילה קרח ומים (מים מלאים עד עומק סך בערך 1 / 3 של צלחת גדולה). בעוד מחזיק את החדר בחוזקה על החלק התחתון של צלחת פטרי 14cm, להשתמש לולאה השיער בעדינות כדי להתמצא העובר כרצונכם ב agarose מותכת והחזק את העובר עד agarose מבצרת בעדינות על ידי העלאת והורדת את צלחת קטנה יותר למיקום המקורי שלה במים קרים כקרח.

4. השתלת תאים בעוברים medaka

מטרת הליך זה היא לקבוע האם הגן של עניין מעשי התא באופן עצמאי (בתוך תא) או אי התא באופן עצמאי (בין תאים).

תאים התורם יכול להיות מתויג עם צבע נותב כגון rhodamine-dextran לפני השתלה (כפי שמתואר "Microinjection עוברים Medaka" הפרוטוקול הנלווה יופיטר) או זן מהונדס עם ביטוי של GFP עשוי להיות מנוצל, המאפשר הערכה השתלה. שילוב של שתי הטכניקות תיוג לעיתים קרובות כדאי להתגבר אוטומטי הקרינה שניתן נתקל. במשך זמן לשגות המחקרים הבאים השתלה, ביטוי של GFP הוא שימושי במיוחד.

השתמש פיפטה פעורת פה זכוכית עם משאבה פיפטה בכל הליך זה לעקר את כל הכלים (כולל שקופיות) מראש EtOH עם 70% ואחריה לשטוף היטב סטרילי 1X BSS. עוברים נמען מפותחים בדרך כלל סביב 12 הבמה כמו זו מאפשרת הפליה של הקטבים הגחון ועל הגב בעת ביצוע ההשתלה.

1. להתחיל dechorionating עוברים 1.5 שעות לפני השתלת הזרקת מנגנון ההתקנה במהלך incubations האנזים.
2. המקום מיקרוסקופ חלל להחליק לתוך צלחת פטרי בקוטר 9cm. הוספת כמות קטנה של 3% methylcellulose למרכז השקופית חלל באמצעות קצה פיפטה סטרילית להפיץ דק.
3. Methylcellulose יבש למשך כ 1-2 דקות.
4. הוסף 350μl של סטרילית 1X BSS למלא דיכאון שקופיות.
5. העברה חד העובר התורם עד ארבעה עוברי הנמען לשקופית באמצעות פיפטה מזכוכית.
6. עוברים להתמצא באמצעות לולאה השיער כך blastoderm העובר פונה מעלה.
   
   עוברים ניתן נשען אחד נגד השני ליציבות עלייה נוספת.
   
   
7. הכנס בעדינות את המחט מיקרו לתוך blastoderm התורם לאט ספיגת 10-20 תאים.
8. הכנס בעדינות מחט לאזור הנדרש blastoderm העובר מקבל ולגרש את התאים לאט. בזהירות רבה יש לנקוט בעת הוספת תאים לתוך blastoderm הנמען כדי לא לשבש את התא שק חלמון גבול כמו זה יהיה לגרום למוות של העובר.
9. יוצקים מעוקרים 1X BSS לתוך צלחת פטרי.
   
   בזהירות לצקת את BSS לתוך צלחת קרוב לצד המנה ככל האפשר, כדי לא לשבש את העוברים. לא לשפוך את BSS ישירות על העוברים ולהוסיף BSS מספיק כזה שקופיות עוברים שקועים.
   
   
10. הוסף 100μl של סטרפטומיצין / פניצילין כדי בצלחת ומכסים. בזהירות כדי להעביר צלחת 27 ° C בחממה כדי לאפשר התפתחות תקינה.
11. עוברים ניתן להבחין מדי פעם לפי הצורך. בעת השימוש השתלת לבצע ולהשיג-of-פונקציה ו / או להציל ניסויים פנוטיפ, כמה שינויים מורפולוגיים נצפתה יכול להיות בגלל ההשפעות של השתלה. כך מספר השתלות נחוצים. לאחר 2-3 ימים, melanophores צריך להיות נוכח על שק החלמון, הראש, העיניים המטען. אם נוכח העוברים המושתלים על כך מוצלח הכימרה יש ככל הנראה יוצרו (איור 3).

אם התורם הצורך, גנוטיפ העובר (ים) על ידי העברת צינור PCR (ים) המכיל 25μl של 20mg/ml proteinase ק לדגור על 55 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ואחריו 10 דקות 94 ° C ו לבצע PCR.

5. נציג תוצאות

איור 2. בעמדה דוגמה של העובר agarose-מוטבע. Anterior מוצג מימין ולהציג היא הגב. לוח ב ': לתאי אנדותל ניתן לראות משני צדי הגוף העובר מסומנים בעזרת ה-GFP מונע על ידי האמרגן fli.

איור 3. תמונות של הפוסט השתלת עוברים. תמונה מראה העובר התורם והמקבל מיד לאחר ההשתלה. העובר התורם מוצג בצד ימין עם blastoderm אדום לחלוטין (חץ). העובר מקבל מוצג משמאל מזוהה בקלות על ידי המסה קטנה של התאים המושתלים אדום גלוי blastoderm (ראש חץ). תמונה ב 'מציגה שני עוברי מקבל כ -7 שעות לאחר ההשתלה (מודגרות ב 27 ° C). שימו לב התאים המושתלים היגרו מהאתר של השתלת מפוזרים כיום ברחבי blastoderm (חיצים). תמונה ג'מציגה העובר מקבל את st.29 (כ 74hpf). שים לב פיגמנטציה בעיניים את הנוכחות של melanophores באזור תא המטען המוח (חיצים). Rhodamine שכותרתו התאים ניתן לראות להיות מיישבים רבים של מבנים עובריים המציין את ייצור מוצלח של תעתוע.

Discussion

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך dechorionate ולבצע transplanataion על תא עוברי medaka. זוהי טכניקה רבת עוצמה כדי לייצר עוברים chimeric לחקר תפקוד הגנים / חלבון במהלך הפיתוח, כמו גם הבהרת את האוטונומיה של הגן / החלבון המדובר. Medaka הם מערכת מודל שימושי עבור החולייתנים טכניקה זו עקב מפות גורל מבוססת היטב ההלוואות שלהם שקיפות אותם היטב בתחום ההדמיה בזמן אמת vivo. השתלה ניתן לשלב עם microinjection (כפי שמתואר "Microinjection של Medaka עוברים" הפרוטוקול הנלווה יופיטר) כך את התנהגותו של התאים המושתלים ניתן להבחין בקלות.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Embryo medium	Reagent	Made in-house	N/A	200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)
Micro-dissecting forceps	Tools	55 INOX A.DUMONT&FILS	N/A	Very sharp fine tips for removal of chorion.
Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size	Tools	Hermes Abrasives Ltd.	N/A	Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.
3% methylcellulose	Reagent	Sigma	M 0512	High viscosity for holding embryos in place during transplantation.
1X BSS	Reagent	Made in-house	N/A	20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.
Penicillin-streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122	Added to BSS when incubating dechorionated embryos.
Pronase	Reagent	Calbiochem	53702	For dechorionation.
Hatching enzyme	Reagent	Made in-house	N/A	For dechorionation.
Tricaine mesilate (TMS)	Reagent	Sigma	A-5040	400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.
3% ultra-low gelling temp. agarose	Reagent	Sigma	A-2576	Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.
Petri dish culture chamber	Tool	Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.	11-004-008	Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.
Micromanipulator	Equipment	Narishige	N/A	Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.
Borosilicate glass capillaries	Tool	Harvard Apparatus	GC100-10T	For making transplantation needles.
Flaming/Brown micropipette puller	Equipment	Sutter Instrument Co.	Model P-97	For making transplantation needles.