Summary
Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.
Abstract
Door het fuseren van het groen fluorescent eiwit aan hun favoriete eiwitten, biologen hebben nu de mogelijkheid om te studeren wooncomplex cellulaire processen met behulp van fluorescentie microscopie video. Om de bewegingen van het humaan immunodeficiëntie virus kern eiwit tijdens de cel-cel overdracht van het humaan immunodeficiëntie virus, hebben we de Gag eiwit in het kader van een besmettelijke moleculaire kloon van HIV, de zogenaamde HIV Gag-iGFP GFP-gelabeld. We bestuderen deze virale klonen met behulp van video-confocale microscopie. In de volgende gevisualiseerd experiment, we transfecteren een humane T-cellijn met HIV Gag-iGFP, en we gebruiken fluorescent gelabelde niet-geïnfecteerde CD4 + T-cellen om te dienen als doelcellen voor het virus. Met behulp van de verschillende fluorescerende labels kunnen we virale productie en het transport gemakkelijk te volgen over intercellulaire structuren, genaamd virologische synapsen. Eenvoudige zuurstofdoorlatende imaging kamers stellen ons in staat synapsen observeren met live confocale microscopie van minuten tot dagen. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt om virale eiwitten volgen als ze bewegen in van de ene cel naar de volgende.
Protocol
Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Hübner et al., Science 323:. 1743-1747 (2009) .
1. Overzicht
Cel-cel verspreiding van HIV werd oorspronkelijk beschreven met behulp van HIV-geïnfecteerde cellen Jurkat als donor cellen en primaire CD4 + T-lymfocyten als acceptor cellen 1,2,3. In deze studies werd het virus aangetroffen in vaste cellen met behulp van antilichaam kleuring. Om spoor van de overdracht van het virus van cel naar cel in levende cellen, maken we gebruik van een recombinant, besmettelijke moleculaire kloon van HIV genaamd HIV Gag-iGFP 4. Het draagt het groen fluorescerend eiwit (GFP) intern ingebracht in de Gag eiwit tussen de MA en CA-domeinen. Deze moleculaire kloon van HIV behoudt besmettelijkheid, zonder de noodzaak voor helper virus. Virusdeeltjes gemaakt van deze kloon zijn stoichiometrisch geladen met groen fluorescerend eiwit, die een sterke fluorescentie signaal naar virale montage en overdracht tussen cellen te controleren. Bij gebruik in combinatie met inert cell-tracking fluorescerende kleurstoffen, ontvangende cellen onderscheiden kunnen worden van input donor cellen, en waardoor een op de overdracht van hiv van een geïnfecteerde T-cel aan een niet-geïnfecteerde T-cel 5 visualiseren. Virologische synapsvorming en overdracht van het virus van de ene cel naar de andere kan dan worden waargenomen in levende cellen terwijl ze worden gekweekt in een gesloten, gas-doorlatende imaging kamer.
(Dag 1)
2. Voorbereiding van HIV Gag-iGFP Getransfecteerde Jurkat T-cellen
- Bereid de menselijke CD4 + T-cellijn Jurkat (ATCC, Manassas, VA) door zorgvuldig onderhoud van de cellen bij een concentratie tussen de 2 x 10 5 en 8 x 10 5 cellen / ml in Jurkat cultuur media (RPMI 1640, 10% foetaal runderserum, 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). Sleutel tot succes: Cultuur van de Jurkat cellen in concentraties van meer dan 8 x 10 5 cellen / ml zal resulteren in een vermindering van de transfectie-efficiëntie.
Opmerking: De transfectie van HIV Gag-iGFP proviraal DNA in T-cellen, zoals hieronder beschreven, resulteert in de productie van een replicatie-competente humaan immunodeficiëntie virus. Als zodanig, alle procedures worden uitsluitend door geschoold laboratorium personeel in gecertificeerde bioveiligheidsniveau 2 + of bioveiligheid niveau 3 (BL2 + / BL3) weefselkweek kamers. Werken met besmettelijke hiv in de beeldvorming voorzieningen moeten worden goedgekeurd door uw lokale institutionele bioveiligheid kantoor. - Transfecteren de Jurkats met de virale plasmide, HIV Gag-iGFP met behulp van de Amaxa nucleofection methode (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 150 x g. Aspireren supernatant en was de cellen in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer de cellen en resuspendeer de pellet tot 97 ul van voorverwarmde, nucleofector oplossing V die de fabrikant aan te vullen. Voeg drie ul van endotoxine gratis HIV Gag-iGFP plasmide (1 pg / pl) om de celsuspensie en meng voorzichtig. Breng de celsuspensie om een cuvet en nucleofect met behulp van het programma S-18. Onmiddellijk overdracht van de cellen tot 3 ml voorverwarmd Jurkat cultuur media zonder antibiotica.
- Voor te bereiden CD4 + doelcellen voor virologisch synapsen, krijgen we humane perifere bloed mononucleaire cellen van buffy coats met behulp van een standaard Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Zweden) protocol. CD4 + T-cellen worden vervolgens negatief geselecteerd met behulp van een magnetisch bolletje isolatie kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Deze kunnen cryogeen worden opgeslagen in vloeibare N2 in porties van 5 x 10 6 cells/500 ul van bevriezing media (90% foetaal runderen serum/10% DMSO). Ontdooid primaire CD4 + T-cellen worden gekweekt in RPMI 10% FBS, aangevuld met 10 eenheden / ml IL-2.
(Dag 2)
3. Herstel van de levende cellen van Jurkats getransfecteerd met HIV Gag-iGFP en kleuring van Target Cellen met fluorescente kleurstoffen
- Laat de Jurkat cellen om 's nachts herstellen van de transfectie. Verwijder vervolgens de cellulaire puin door centrifugeren op een Ficoll Hypaque dichtheidsgradiënt materiaal. Doseer 1,5 ml Ficoll-Paque aan de onderkant van een 15 ml conische buis. Voorzichtig overlay deze gradiënt materiaal met de getransfecteerde Jurkats in een 5 ml volume van RPMI. Centrifugeer de cellen op 400 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur met de rem af. Verwijder voorzichtig de cellen uit de media / Ficoll-interface met behulp van een pipet. Overbrengen naar een nieuwe 15 ml conische buis. Verdun de cellen met RMPI tot een totaal volume van 15 ml en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in 3 ml Jurkat cultuur media in een 2 cm goed (6-well plaat) en terug de cellen naar de weefselkweek incubator.
- Te onderscheiden doel cellen van donor cellen in cel-cel overdracht experimenten we prelabel de CD4 + doelcellen met fluorescerende kleurstoffen. Primaire CD4 + T-cellen zijn het zelfs het labeling voor gebruik. We hebben een uitstekende succes etikettering T-cellen met zowel CellTracker en CellTrace kleurstoffen (Invitrogen, Carlsbad, CA). Terwijl de kleurstof concentratie en incubatie tijden moeten worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de specifieke kleurstof en de gebruikte celtype, een vertegenwoordiger van het protocol volgt. Pellet 4 x 10 6 primaire CD4 + T-cellen door het draaien op 400 xg gedurende 10 minuten. Was de cellen met 5 ml PBS en resuspendeer in 2 ml PBS. Voeg CellTracker Oranje (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 uM en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Voeg 8 mL van complete Jurkat media en centrifugeer op 400 xg gedurende 10 minuten. Resuspendeer de cellen in 3 ml compleet media, aangevuld met 10 eenheden / ml IL-2 en plaats in de weefselkweek incubator 's nachts.
(Dag 3)
4. Monitoring Cel-cel Overdracht van HIV Gag-iGFP met behulp van live cell imaging
We routinematig gebruik van HIV Gag-iGFP getransfecteerde Jurkat-cellen 48 uur na transfectie. We hebben echter met succes gebruikt cellen al in 24 uur, en zo laat 72 uur na transfectie.
- Ongeveer 48 uur na transfectie, zijn HIV Gag-iGFP uitdrukken Jurkats geteld, gewassen met CO 2-onafhankelijke media (Invitrogen, Carlsbad, CA), en geresuspendeerd in live cell imaging media (CO 2 onafhankelijke media, 10% foetaal runderserum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, 10 eenheden / ml IL-2) bij een concentratie van 1-3 x 10 7 cellen / ml.
- Op een soortgelijke manier, wassen en resuspendeer label primaire CD4 + T-cellen bij een concentratie van 1-3 x 10 7 cellen / ml in live cell imaging media.
- Mix HIV Gag-iGFP-getransfecteerd Jurkats met een primaire CD4 + T-cellen op een 1:2 of 1:3 verhouding en laden in een behandeld weefselkweek, zuurstofdoorlatende, microchamber (Ibidi, Verona, WI). Bijvoorbeeld, mix 20 ul van HIV Gag-iGFP getransfecteerd Jurkats met 40 pl van het label primaire CD4 + T-cellen. Belasting 50 ul van dit mengsel in een Ibidi kamer en sluit de kamer met pluggen. Zet de stekkers door het wikkelen de stekker / Ibidi kamer-interface met parafilm.
5. Overwegingen voor microscopie platforms: spinning disk confocale imaging
Na het laden van een Ibidi imaging kamer met cellen, hebben we meteen monteren van het apparaat op een omgekeerde optische microscoop (iX71 Olympus, Center Valley, PA). De Ibidi kamer moet worden overgedragen aan de microscoop alleen door BL2 +-geschoold laboratorium personeel het dragen van veiligheids-kleding. Hoewel de live-cell imaging vaak gebruik maakt van dure incubatie kamers te handhaven van een stabiele 37 ° C, dit werd bereikt met behulp van een eenvoudige en economische thermostatische verwarming (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) samen met een T-type thermokoppel tip gemonteerd naast de het monster voor de juiste temperatuur feedback. Wij hebben gevonden met behulp van CO 2-onafhankelijke media stelt ons in staat om hoge levensvatbaarheid van de cellen te behouden terwijl het vermijden van het gebruik van een CO 2 kamer. Om het platform tegen temperatuurschommelingen buffer in de kamer en te blokkeren achtergrond licht wordt blootgesteld, is een grote zwarte sluier gedrapeerd over de hele microscoop / verwarming setup het creëren van een geïsoleerde luchtzak rond het systeem. Dit reduceert variatie in temperatuur en de bijbehorende temperatuur-gerelateerde sample drift, maar vereist voorverwarmen gedurende 30 minuten voorafgaand aan de montage van het monster.
6. Data Acquisition, Transfer en Beeldverwerking
Beelden worden genomen met een 60x 1,42 NA olie-immersie objectief (UPlanApo N, Olympus) als de hoge numerieke apertuur (NA) sterk verbetert resolutie. Voor het maken van 3D-confocale beelden, is het scannen uitgevoerd door een draaiende schijf confocale eenheid (CSU-10, Yokagawa, Japan) die tegelijkertijd gebruik maakt van> 800 confocale plekken om drastisch te verhogen van de scansnelheid. Te complimenteren de snelheid, de CSU-10 is gekoppeld met een zeer gevoelige elektron-vermenigvuldigen charged-coupled device (EMCCD, IXON + 897, Andor Technologies, Ierland) camera aan op een snelle, weinig licht beeldvorming die zowel fotobleken en fototoxiciteit vermindert mogelijk te maken. De fluorescentie lichtbron is een multi-golflengte ArKr ion gas laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), waar de gewenste golflengte (488 nm) en laser-vermogen gemeten vlak voor de microscoop doelstelling (<1 mW) worden geselecteerd door een akoestisch- optic instelbare filter (AOTF), (Andor Technologies). Verder te verminderen fotobleken en uitbreiding van het Total Imaging tijd, de AOTF snel (microseconden) schakelt de laserstraal elke keer dat de camera niet actief is (10-20 ms), terwijl de nieuw verworven afbeelding is verlost van de CCD (15-30 ms belichting) op de computer. Het laserlicht wordt gekoppeld in het draaiende schijf systeem met behulp van een 405/488/568/647 quad-band dichroïsche spiegel (Semrock, Rochester, NY). Fluorescentie-emissie wordt gefilterd met behulp van een 525/50 bandpass filter (Semrock) in een filter wiel (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) gemonteerd between de EMCCD camera en de confocale draaiende schijf unit. Alle hardware en acquisitie, waaronder een z-fase (Mad Labs Stad, Madison, WI), worden gecontroleerd door de Andor iQ v1.8-software. Om de snelheid van de overname te maximaliseren rond de 1.2-1.9 seconde 3D-beeld stacks, we gewas de opname regio van de camera van de EMCCD's naar de cel-pair van de directe omgeving. Bovendien ten koste van bepaalde informatie in z, kan een grote z-stap tussen 0.45-0.75 um worden gebruikt voor het versnellen acquisitie. Beeldvorming onder deze voorwaarden kan duren tot 6 uur - met een continue 20-60 minuten segmenten - met minimale fotobleken. In totaal, elke data segment neemt meestal 50 tot 20 Gb aan ruimte als tienduizenden foto's worden genomen. Ter vergemakkelijking van het transport en de analyse van de grote gegevensbestanden, elke overname ingesteld moet worden afgebroken en geëxporteerd worden als 1 Gb TIFF-afbeeldingsbestand segmenten met behulp van de Andor iQ v1.8-software. Vanaf hier, veel uitstekende software pakketten zijn beschikbaar voor beeldanalyse, zoals Metamorph, Volocity en ImageJ (wij raden de variatie Fiji).
Wanneer twee fluorescerende markers worden gevolgd, hebben we gelijktijdig opnemen beiden zonder te vertragen overname door het gebruik van een "split-screen mode." Beide markers zijn opgewonden door twee verschillende ArKr laserlijnen in een keer (vaak 488 en 568 nm). Direct ingevoegd vóór de EMCCD camera is een afbeelding splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, Verenigd Koninkrijk) dat de twee verschillende beelden van elkaar scheidt. Elk beeld wordt vervolgens zelfstandig gefilterd met behulp van fluorescentie filters (Semrock) en geprojecteerd side-by-side op de camera in een keer het creëren van de 'split-screen "effect. Dit zou dan vereisen handmatige bijsnijden en het afstemmen van de beelden later in beeldverwerking.
7. Overwegingen voor Image Processing en data-analyse
We meestal voeren beeldanalyse met Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) op Macintosh-computers (Apple, Inc). Draaiende schijf laser confocale microscopie beelden worden eerst aangepast in hun intensiteit om te corrigeren voor photobleaching, dan deconvolved met Volocity. Intensiteit van metingen en het volgen van de Gag puncta is uitgevoerd met de kwantificering Volocity module. Voor het imago bepaalt waar de beweging ten opzichte van een voorgevormde synaps moet worden berekend, is een geautomatiseerd tracking algorithme gebruikt die tracks van de synaptische knop de hele reeks. Handmatige controle van de regio's van belang, zoals omschreven door de Automatische spoorvolging software moet worden uitgevoerd om te bevestigen dat de software correct heeft het gewenste object gevolgd. Voor objecten waarbij het contrast met de omringende objecten is te zwak is, kan handmatige tracking worden uitgevoerd op een frame-by-frame basis. De Volocity software pakket laat de export van XYZ locatie, het volume en geïntegreerd signaal binnen de gewenste objecten. De afstand van de synaps en de snelheid van het object gevolgd worden berekend door het normaliseren van bewegingen naar het midden van de synaptische knop.
8. Representatieve resultaten
Binnen 10 tot 15 minuten van het mengen moet men in staat zijn om HIV Gag-expressie iGFP Jurkat cellen vast te houden aan de primaire CD4 + T-cellen te visualiseren. Imaging deze conjugaten, kan men beoordelen de bewegingen van de Gag puncta in geïnfecteerde cellen als in target cellen na synaspe. Men kan de beweging van de Gag-iGFP puncta al snel te observeren in doel-cellen na synapsen worden gevormd.
Discussion
We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het visualiseren van de overdracht van HIV van cel-cel. Recent onderzoek van ons laboratorium en anderen 'suggereert dat dit misschien wel de belangrijkste functie van HIV-spread tussen T-cellen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een recombinante vorm van HIV, de zogenaamde HIV Gag-iGFP, die een genetisch gecodeerd groen fluorescerend eiwit-tag in de kern van structurele eiwitten, Gag draagt. Omwille van de hoge niveaus van GFP geproduceerd in elk virus deeltje, dit replicatie-competent kloon van HIV stelt onderzoekers in staat om individuele virusdeeltjes track in real time. Dit virus zou vooral nuttig zijn in studies met betrekking tot de montage en de cel-cel overdracht van HIV.
De overdracht van HIV door de cel-cel-overdracht is zeer efficiënt. Tijdens een drie uur durende co-cultuur, we routine zien virus overgebracht naar 20-30% van primaire T-cellen als beoordeeld door flowcytometrie. Vergelijkbare rendementen zijn kwalitatief gezien tijdens live cell imaging. Viraal geïnfecteerde T-cellen beginnen de vorming van synapsen met niet-geïnfecteerde primaire T-cellen vrijwel direct na de inleiding van co-cultuur. Interessant, niet alle primaire T-cellen in staat zijn om interactie met HIV-geïnfecteerde cellen Jurkat ondanks de gedwongen interacties met laser een pincet (niet-gepubliceerde waarnemingen, GM). HIV Gag-iGFP zal ongetwijfeld nuttig zijn voor het bepalen van T-cel subsets die het meest gevoelig zijn voor cel-cel transfer, zowel in vitro als in vivo.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze recensie werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Career Scientist Awards voor BKC en door de NSF Center for Biofotonica Wetenschap en Technologie, Coöperatieve overeenkomst PHY012099, en een UCD Health System Research Award voor TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J Exp Med. 199, 283-293 (2004).
- Hubner, W. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. J Virol. 81, 12596-12607 (2007).
- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
