Summary
Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.
Abstract
Fundindo a proteína verde fluorescente para suas proteínas favorito, os biólogos têm agora a possibilidade de estudar vivos complexos processos celulares através de microscopia de fluorescência de vídeo. Para acompanhar os movimentos da proteína do núcleo do vírus da imunodeficiência humana durante a transmissão célula a célula do vírus da imunodeficiência humana, temos GFP-tagged a proteína Gag no contexto de um clone infeccioso molecular do HIV, chamado HIV-Gag iGFP. Estudamos esse clone viral por microscopia confocal de vídeo. No experimento seguinte visualizadas, nós transfectar uma linhagem de células T humanas com HIV Gag iGFP, e nós usamos fluorescente etiquetado CD4 + não infectadas as células T para servir como células-alvo para o vírus. Usando o rótulos diferentes fluorescentes podemos facilmente seguir a produção viral e transporte através de estruturas chamadas sinapses intercelular virológica. Simples câmaras de gás permeável imagens nos permitem observar sinapses com microscopia confocal viver de minutos a dias. Estas abordagens podem ser usadas para rastrear as proteínas virais como eles se movem na de uma célula para outra.
Protocol
Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Hübner et al Ciência 323:. 1743-1747 (2009) .
1. Visão global
Célula a célula-propagação do HIV foi originalmente descrita utilizando células Jurkat infectadas pelo HIV como células do doador e CD4 + primárias linfócitos T como células aceitador 1,2,3. Nestes estudos, o vírus foi detectado em células fixas usando coloração de anticorpos. Para acompanhar a transferência do vírus de célula a célula em células vivas, nós explorar um recombinante, clone infeccioso molecular do HIV chamado HIV Gag-iGFP 4. Ele carrega a proteína verde fluorescente (GFP) inserida internamente na proteína da mordaça entre os domínios MA e CA. Este clone molecular do HIV mantém infectividade sem a necessidade de vírus auxiliares. Partículas do vírus a partir desta clone são estequiometricamente carregado com proteína fluorescente verde, proporcionando um forte sinal de fluorescência para monitorar a montagem viral e transferência entre as células. Quando usado em conjunto com inertes de células-tracking corantes fluorescentes, pilhas destinatário pode ser discriminado a partir de células de doadores de entrada, e permitindo que se visualize a transferência de HIV de uma célula T infectada para uma célula T não infectados 5. Formação de sinapses virológica e transferência de vírus de uma célula para outra pode ser observada em células vivas, enquanto eles são cultivadas em um selado, câmara de imagem gás-permeáveis.
(Dia 1)
2. Preparação de HIV Gag iGFP-Transfectados Células T Jurkat
- Prepare o CD4 humano + das células T linha Jurkat (ATCC, Manassas, VA) cuidado com a manutenção das células em uma concentração entre 2 x x 10 5 e 8 10 5 células / mL em Jurkat meios de cultura (RPMI 1640, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / mL de penicilina, estreptomicina e 100 mg / mL). Chave para o sucesso: Cultura de células Jurkat em concentrações acima de 8 x 10 5 células / mL irá resultar em uma redução na eficiência de transfecção.
Nota: A transfecção de DNA HIV Gag iGFP-proviral em células T, como descrito abaixo, resulta na produção de uma replicação competente vírus da imunodeficiência humana. Como tal, todos os procedimentos que devem ser realizadas apenas por pessoal treinado em laboratório certificado nível de biossegurança 2 + ou salas de cultura de biossegurança nível 3 (BL2 + / BL3) tecido. Trabalhar com HIV infecciosas em instalações de imagem deve ser aprovado por seu escritório de biossegurança institucional local. - Transfecção do Jurkats com o plasmídeo viral, HIV Gag iGFP usando o método nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 células por centrifugação por 10 min a 150 x g. Aspirar o sobrenadante e lavar as células de fosfato estéril salina tamponada (PBS). Centrifugar as células e ressuspender o sedimento a 97 mL do pré-aquecido V solução, nucleofector contendo suplemento do fabricante. Adicione três mL de endotoxina livre da mordaça iGFP HIV-plasmídeo (1 mg / mL) à suspensão de células e misture delicadamente. Transferir a suspensão de célula para uma cuvete e nucleofect usando o programa S-18. Transferir imediatamente as células a 3 mL de mídia Jurkat pré-aquecido a cultura sem antibióticos.
- Para preparar CD4 + células-alvo para as sinapses virológica, obtemos células mononucleares do sangue periférico de buffy casacos usando um protocolo de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) padrão. Células T CD4 + são, então, negativamente selecionado usando um kit de isolamento magnético talão (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Estes podem ser criogenicamente armazenados em N2 líquido, em alíquotas de 5 x 10 6 cells/500 mL de meios de congelamento (90% de soro fetal bovino DMSO serum/10%). Descongeladas CD4 + células T primárias são cultivadas em RPMI 10% FBS, suplementado com 10 unidades / mL de IL-2.
(Dia 2)
3. Recuperação de células vivas a partir Jurkats Transfectados com HIV Gag iGFP e coloração das células-alvo com corantes fluorescentes
- Permitir que as células Jurkat para se recuperar da transfecção durante a noite. Em seguida, retire os detritos celulares por centrifugação em um gradiente de Ficoll Hypaque material de densidade. Dispense 1,5 mL de Ficoll-Paque para o fundo de um tubo de 15 mL cônico. Delicadamente sobrepor este material com o gradiente Jurkats transfectadas em um volume de 5 mL de RPMI. Centrifugar as células a 400 xg por 20 min à temperatura ambiente com o freio. Remova cuidadosamente as células a partir da interface media / Ficoll usando uma pipeta. Transferi-los para um novo tubo de 15 mL cônico. Diluir as células com RMPI para um volume total de 15 mL e centrifugar a 300 xg por 10 min. Ressuspender o sedimento em 3 mL de meios de cultura em um Jurkat dois centímetros bem (6 bem-placa) e as células voltem ao tecido da cultura incubadora.
- Para diferenciar as células-alvo a partir de células de doadores em experimentos de transferência de célula-célula que prelabel as células CD4 + alvo com corantes fluorescentes. CD4 + primárias células T são rotulados do mesmoing antes de usar. Tivemos excelente sucesso células T rotulagem com as duas CellTracker e corantes CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Enquanto a concentração de corantes e tempos de incubação deve ser otimizada, dependendo do corante especial e com o tipo, um protocolo de representante segue. Pellet 4 x 10 6 CD4 + primárias células T, girando a 400 xg por 10 min. Lavar as células com 5 mL de PBS e ressuspender em 2 mL de PBS. Adicionar CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) para uma concentração final de 1,5 mM e incubar a 37 ° C por 20 min. Adicionar 8 mL de mídia Jurkat completa e centrifugar a 400 xg por 10 min. Ressuspender as células em 3 mL de meio completo suplementado com 10 unidades / mL de IL-2 e coloque na cultura de tecidos incubadora durante a noite.
(Dia 3)
4. Monitoramento de transferência de célula para célula de HIV Gag iGFP usando imagens de células vivas
Nós usam rotineiramente HIV Gag iGFP células Jurkat transfectadas 48 horas após a transfecção. No entanto, temos utilizado com sucesso células nas primeiras 24 horas, e tão tarde quanto 72 horas pós-transfecção.
- Aproximadamente 48 horas após a transfecção, HIV Gag iGFP-Jurkats expressar são contados, lavado com CO 2 de mídia independente (Invitrogen, Carlsbad, CA), e ressuspenso em células vivas mídia de imagem (CO 2 de mídia independente, 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina, estreptomicina e 100 mg / ml, 10 unidades / mL IL-2) em uma concentração de 1-3 x 10 7 células / mL.
- Em uma forma similar, lavar e ressuspender rotulados CD4 + primárias células T com uma concentração de 1-3 x 10 7 células / mL nos meios de comunicação de imagens de células vivas.
- Mix HIV Gag-iGFP transfectadas com CD4 Jurkats principal + células T na proporção 1:2 ou 1:3 e de carga em uma cultura de tecidos tratados, gás permeável, MicroChamber (Ibidi, Verona, WI). Por exemplo, misturar 20 mL de HIV Gag iGFP-Jurkats transfectadas com 40 mL de rotulados CD4 + células T primárias. Carga de 50 mL desta mistura em uma câmara de Ibidi e selar a câmara com plugs. Segura as velas envolvendo a ficha / Ibidi interface de câmara com parafilme.
5. Considerações para as plataformas de microscopia: spinning disco de imagem confocal
Depois de carregar uma câmara de imagem Ibidi com células, nós imediatamente montar o dispositivo em um microscópio invertido óptico (Olympus iX71, Center Valley, PA). A câmara de Ibidi devem ser transferidos para o microscópio apenas por BL2 + pessoal treinado laboratório usa roupas de segurança adequadas. Apesar de viver de células de imagem comumente utiliza câmaras de incubação caro para manter um ambiente estável a 37 ° C, esta foi realizada por meio de um aquecedor simples e econômica termostática (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA), juntamente com uma ponta termopar tipo T montada ao lado a amostra para o gabarito temperatura adequada. Temos encontrado usando CO 2-mídia independente nos permite manter a viabilidade celular de alta, evitando o uso de uma câmara de CO 2. Para atenuar a plataforma contra flutuações de temperatura na sala e para bloquear a luz ambiente de fundo, um preto grande sudário é drapejado sobre a configuração do microscópio / aquecedor de toda a criação de um bolsão de ar com isolamento em torno do sistema. Isso reduz bastante variação de temperatura e deriva de exemplo associado relacionadas com a temperatura, mas exige pré-aquecimento por 30 minutos antes da montagem da amostra.
6. Processamento de Dados Transferência de Aquisição e Imagem
As imagens são tiradas com um 60x 1,42 NA objetivo de imersão em óleo (UPlanApo N, Olympus) como a alta abertura numérica (NA) melhora muito a resolução. Para criar imagens 3D confocal, a verificação é realizada por uma unidade de disco giratório confocal (CSU-10, Yokagawa, Japão) que, simultaneamente, usa> 800 pontos confocal para aumentar drasticamente a taxa de varredura. Para complementar a sua velocidade, o CSU-10 é emparelhado com um altamente sensível elétron-multiplicando dispositivo carregado de acoplamento (EMCCD, ixon + 897, Andor Technologies, Irlanda) da câmera para permitir rápida, de imagens com pouca luz, que reduz a fotodegradação e fototoxicidade. A fonte de luz de fluorescência é um multi-comprimento de onda ARKR ion de gás laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), onde o comprimento de onda desejado (488 nm) e potência do laser medido logo antes da objetiva do microscópio (<1 mW) são selecionados por um acústico- óptico sintonizável filtro (AOTF), (Andor Technologies). Para reduzir ainda mais fotobranqueamento e prolongar o tempo de imagem total, o AOTF rapidamente (microssegundos) desliga o feixe de laser cada vez que a câmera está inativo (10-20 ms) enquanto a imagem recém-adquirido é entregue a partir do CCD (15-30 exposição ms) para o computador. A luz laser é acoplado no sistema de disco giratório com um quad-band 405/488/568/647 dichroic espelho (Semrock, Rochester, NY). Emissão de fluorescência é filtrada usando um filtro passa-banda 525 / 50 (Semrock) dentro de uma roda de filtros (Ludl Produtos eletrônicos, Hawthorne, NY) montado bntre a câmera EMCCD ea unidade de disco confocal girando. Todo o hardware e aquisições, incluindo um z-stage (Mad City Labs, Madison, WI), são controlados pelo iQ Andor v1.8 software. Para maximizar a velocidade de aquisição em torno de 1,2-1,9 segundo pilhas de imagens 3D, de culturas na região de gravação de câmera de baixo para EMCCD área imediata da célula par de. Além disso, à custa de algumas informações em z, um grande passo z entre 0,45-0,75 M pode ser usada para acelerar a aquisição. Imagem sob essas condições pode durar até seis horas - utilizando segmentos minutos contínuos 20-60 - com fotobranqueamento mínimo. Ao todo, cada segmento de dados ocupa tipicamente 50-20 Gb de espaço como dezenas de milhares de imagens são tomadas. Para facilitar o transporte e análise dos arquivos de dados de grande porte, cada conjunto de aquisição precisa ser quebrado e exportada como TIFF segmentos 1 Gb de arquivos de imagem usando o Andor iQ v1.8 software. A partir daqui, muitos pacotes de software excelentes estão disponíveis para análise de imagem, tais como Metamorph, Volocity e ImageJ (recomendamos sua variação Fiji).
Quando dois marcadores fluorescentes devem ser controladas, nós gravar simultaneamente os dois sem abrandar a aquisição através de um "modo de ecrã dividido." Ambos os marcadores está animado por duas linhas diferentes de laser ARKR menos uma vez (muitas vezes 488 e 568 nm). Inserido diretamente diante da câmera EMCCD é uma imagem de divisão (OptoSplit II, Cairn, Kent, Reino Unido) que separa as duas imagens diferentes. Cada imagem é, então, independentemente filtrada usando filtros de fluorescência (Semrock) e projetados lado a lado da câmera ao mesmo tempo criando o "split-screen" efeito. Este seria, então requerem corte manual e alinhamento das imagens mais tarde, em processamento de imagem.
7. Considerações para Processamento de Imagem e Análise de Dados
Nós normalmente executam análise de imagem com Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) em computadores Macintosh (Apple, Inc). Spinning disco laser de imagens de microscopia confocal são primeiramente ajustados em sua intensidade para corrigir fotobranqueamento, então deconvolved com Volocity. Medições de intensidade e acompanhamento de puncta Gag é realizada com o módulo de Quantificação Volocity. Para conjuntos de imagens onde o movimento relativo a uma sinapse pré-formado precisa ser calculado, um algoritmo de monitoramento automatizado é empregado que monitora o botão sináptico durante toda a seqüência. Inspeção manual das regiões de interesse definidas pelo software autotracking devem ser realizados para confirmar que o software tem rastreado corretamente o objeto desejado. Para objetos onde o contraste com os objetos no ambiente é muito fraco, rastreamento manual pode ser feita numa base de quadro-a-quadro. O pacote de software Volocity permite a exportação de XYZ localização, volume e sinal integrado os objetos desejados. A distância entre a sinapse e velocidade do objeto rastreado são calculados através da normalização do movimento para o centro do botão sináptico.
8. Resultados representante
Dentro de 10 a 15 minutos de mistura deve ser capaz de visualizar HIV Gag iGFP células Jurkat expressar aderir a CD4 + células T primárias. Imagem destes conjugados, pode-se avaliar os movimentos de puncta mordaça nas células infectadas, bem como em células-alvo após synaspe. Pode-se observar o movimento da mordaça iGFP-puncta em células-alvo logo após sinapses são formadas.
Discussion
Descrevemos aqui um método simples para visualizar a transmissão de HIV de célula-célula. Uma pesquisa recente de nosso laboratório e outros sugere que este pode ser o modo predominante de transmissão do HIV entre as células T. O método descrito aqui utiliza uma forma recombinante do HIV, chamado HIV-Gag iGFP, que carrega um geneticamente codificado tag proteína verde fluorescente no estruturais da mordaça proteína do núcleo,. Por causa dos níveis elevados de GFP produzidos em cada partícula do vírus, este clone replicação competente do HIV permite aos pesquisadores para rastrear partículas de vírus individuais em tempo real. Este vírus devem ser especialmente útil em estudos sobre a transferência de montagem e célula-célula de HIV.
A transferência de HIV por célula-célula de transferência é altamente eficiente. Durante uma hora, três co-cultura, de rotina, vemos vírus transferido para 20-30% de células primárias de T, avaliado por citometria de fluxo. Eficiências semelhantes são qualitativamente visto durante imagens de células vivas. Infectadas por vírus de células T começam sinapses formando com células primárias de T não infectadas, quase imediatamente após o início da co-cultura. Interessante, nem todas as células T primárias são capazes de interagir com as células infectadas pelo HIV Jurkat apesar interações forçadas com laser pinças (observações não publicadas, GM). HIV-Gag iGFP será sem dúvida útil para determinar subpopulações de células T que são mais suscetíveis a célula-transferência, tanto in vitro como in vivo.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta revisão foi apoiado pelo National Institutes of concede Saúde, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, prémios de carreira Hirschl Scientist para BKC e pelo Centro de NSF para Biophotonics Ciência e Tecnologia, Acordo de Cooperação PHY012099, e uma Saúde UCD Prêmio de Pesquisa do Sistema para TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
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- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
