Summary
Detta visualiseras experiment är en guide för att utnyttja en fluorescerande molekyl klon av hiv för live konfokala imaging experiment.
Abstract
Genom att smälta det grönt fluorescerande protein för att deras favorit proteiner, biologer har nu möjligheten att studera levande komplexa cellulära processer med hjälp av fluorescens video mikroskopi. Att spåra förflyttningar av humant immunbristvirus core protein under cell till cell överföring av humant immunbristvirus, vi har GFP-märkta gag protein i samband med en smittsam molekylär klon av hiv som kallas hiv Gag-iGFP. Vi studerar detta virus klon med hjälp av video konfokalmikroskopi. I följande visualiseras experimentet transfektera vi en human T cell linje med hiv Gag-iGFP, och vi använder fluorescerande oinfekterade CD4 + T-celler att fungera som målceller för viruset. Med hjälp av olika fluorescerande etiketter kan vi lätt följa virus produktion och transport över intercellulära strukturer som kallas virologiska synapser. Enkel gas permeabla avbildning kammare tillåter oss att observera synapser med live konfokalmikroskopi från minuter till dagar. Dessa metoder kan användas för att spåra virus proteiner när de flyttar in från en cell till nästa.
Protocol
Denna metod användes i forskningen redovisas i Hübner et al Science 323:. 1743-1747 (2009) .
1. Översikt
Cell-till-cell spridningen av hiv beskrevs ursprungligen med hjälp av HIV-infekterade Jurkat celler som donator element och CD4 + T-lymfocyter som acceptor celler 1,2,3. I dessa studier var viruset upptäcktes i fasta celler med antikroppar färgning. För att spåra överföringen av virus från cell till cell i levande celler, utnyttjar vi en rekombinant, smittsam molekylära klon av hiv som kallas hiv Gag-iGFP 4. Det bär det grönt fluorescerande protein (GFP) som sätts internt i Gag proteinet mellan MA och CA-domäner. Denna molekylära klon av hiv behåller smittsamhet utan behov av hjälpare virus. Viruspartiklar gjorda av denna klon är stökiometriskt laddade med grönt fluorescerande protein, som ger en stark fluorescens signal att övervaka virus montering och överföring mellan celler. Vid användning i kombination med inerta cell-spårning fluorescerande färger, kan mottagaren celler diskrimineras från celler ingång donator, och tillåter en att visualisera överföring av hiv från en smittad T-cell med infektionsfria T-cell 5. Virologiska synaps bildning och överföring av viruset från en cell till en annan kan sedan iakttas i levande celler medan de odlas i en förseglad, gas genomsläppliga avbildning kammare.
(Dag 1)
2. Beredning av hiv Gag-iGFP transfekterade Jurkat T-celler
- Förbered humana CD4 + T cell linje Jurkat (ATCC, Manassas, VA) genom att försiktigt hålla cellerna vid en koncentration mellan 2 x 10 5 och 8 x 10 5 celler / ml i Jurkat odlingsmedia (RPMI 1640, 10% fetalt bovint serum, 100 enheter / ml penicillin, och 100 mikrogram / ml streptomycin). Nyckeln till framgång: Kultur i Jurkat cellerna vid koncentrationer som överstiger 8 x 10 5 celler / ml kommer att resultera i en minskning av transfektion effektivitet.
Obs: transfektion av hiv Gag-iGFP proviral DNA i T-celler, som beskrivs nedan, resulterar i produktionen av en replikationskompetenta humant immunbristvirus. Som sådan, alla förfaranden för att endast användas av utbildad laboratoriepersonal i certifierade biosäkerhetsnivån 2 + eller biosäkerhetsnivå 3 (BL2 + / BL3) vävnadskultur rum. Arbeta med smittsam HIV i bildbehandling anläggningar måste godkännas av din lokala institutionella biosäkerhet kontor. - Transfektera den Jurkats med virus plasmiden, HIV Gag-iGFP med Amaxa nucleofection metoden (Lonza, Walkersville, MD). Pellets 5 x 10 6 celler genom centrifugering i 10 min vid 150 x g. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera cellerna och suspendera pelleten till 97 mikroliter av förvärms, nucleofector lösning V innehåller tillverkarens tillägg. Tillsätt tre mikroliter av endotoxiner gratis hiv Gag-iGFP plasmid (1 mikrogram / l) till cellsuspensionen och blanda försiktigt. Överför cellsuspension till en kyvett och nucleofect använda programmet S-18. Omedelbart överföra celler till 3 ml uppvärmd medier Jurkat kultur utan antibiotika.
- För att förbereda CD4 + målceller för virologisk synapser, får vi humana perifera mononukleära blodceller från buffy rockar genom att använda en vanlig Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) protokollet. CD4 + T-celler då negativt väljs med hjälp av en magnetisk pärla isolering kit (Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornien). Dessa kan cryogenically förvaras i flytande N2 i portioner av 5 x 10 6 cells/500 mikroliter av frysning medier (90% fetalt bovint serum/10% DMSO). Tinade primära CD4 + T-celler odlas i RPMI 10% FBS, kompletterat med 10 enheter / mL IL-2.
(Dag 2)
3. Återvinning av levande celler från Jurkats transfererats med hiv Gag-iGFP och färgning av målceller med fluorescerande färger
- Låt Jurkat cellerna att återhämta sig från den transfektion natten. Ta sedan bort den cellulära skräp genom centrifugering under ett Ficoll hypaque densitetsgradient material. Tillsätt 1,5 ml Ficoll-Paque till botten av en 15 ml koniska rör. Försiktigt överlägg denna gradient material med transfekterade Jurkats i en 5 ml volym RPMI. Centrifugera cellerna vid 400 xgi 20 minuter vid rumstemperatur med bromsen avstängd. Ta försiktigt bort celler från media / Ficoll gränssnitt med en pipett. Överföra dem till en ny 15 ml koniska rör. Späd celler med rmpi till en total volym på 15 ml och centrifugera vid 300 xg under 10 min. Återsuspendera pelleten i 3 ml Jurkat kultur media i en 2 cm väl (6-brunnar) och gå tillbaka cellerna till vävnadsodling inkubatorn.
- För att skilja målceller från givare celler i cell-cell transfer experiment vi prelabel CD4 +-målet celler med fluorescerande färger. Primär CD4 + T-celler är märkta med jämnaning före användning. Vi har haft goda framgångar märkning T-celler med både CellTracker och färgämnen CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Medan färgen koncentration och inkubationstider måste optimeras beroende på de särskilda färgämne och celltyp som används, följer en representant protokoll. Pellets 4 x 10 6 primära CD4 + T-celler genom att snurra på 400 xgi 10 min. Tvätta cellerna med 5 mL PBS och återsuspendera i 2 ml PBS. Lägg CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) till en slutlig koncentration av 1,5 mikroM och inkubera vid 37 ° C i 20 minuter. Tillsätt 8 ml kompletta Jurkat media och centrifugera vid 400 xg under 10 min. Resuspendera cellerna i 3 ml komplett media kompletteras med 10 enheter / mL IL-2 och plats i vävnadsodling inkubatorn natten.
(Dag 3)
4. Övervakning cell till cell Överföring av HIV Gag-iGFP med levande cell imaging
Vi använder rutinmässigt HIV Gag-iGFP transfekterade Jurkat celler 48 timmar efter transfektion. Vi har dock använts framgångsrikt celler så tidigt som 24 timmar, och så sent som 72 timmar efter transfektion.
- Cirka 48 timmar efter transfektion, är hiv Gag-iGFP uttrycka Jurkats räknas, tvättas med CO 2-oberoende medier (Invitrogen, Carlsbad, CA) och suspenderade i levande cell imaging media (CO 2 oberoende medier, 10% fetalt bovint serum, 100 E / ml penicillin, och 100 mikrogram / ml streptomycin, 10 enheter / mL IL-2) vid en koncentration på 1-3 x 10 7 celler / ml.
- På ett liknande sätt, tvätta och återsuspendera märkt Primärt CD4 + T-celler vid en koncentration på 1-3 x 10 7 celler / ml i levande media cell imaging.
- Blanda hiv Gag-iGFP-transfekterade Jurkats med primär CD4 + T-celler vid en 1:2 eller 1:3-förhållande och ladda i en behandlad vävnad kultur-, gas permeabla, microchamber (Ibidi, Verona, WI). Till exempel, blanda 20 mikroliter av HIV Gag-iGFP transfekterade Jurkats med 40 mikroliter av märkt primära CD4 + T-celler. Belastning 50 mikroliter av denna blandning i en Ibidi kammare och försegla kammaren med pluggar. Säkra kontakterna genom att linda i kontakten / Ibidi kammare gränssnitt med parafilm.
5. Överväganden för mikroskopi plattformar: spinning disk konfokala imaging
Efter att ha laddat en Ibidi avbildning kammare med celler, montera vi omedelbart enheten på ett inverterat ljusmikroskop (iX71 Olympus, Center Valley, PA). Den Ibidi kammare bör överföras till mikroskop endast BL2 +-utbildad laboratoriepersonal bära lämpliga säkerhetsåtgärder plagg. Även live-cell imaging ofta använder dyra inkubation kammare för att upprätthålla en stabil 37 ° C miljö, var detta uppnås med hjälp av en enkel och prisvärd termostat värmare (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) tillsammans med en T-typ termoelement tips monterad bredvid provet för rätt temperatur feedback. Vi har funnit med hjälp av CO 2-oberoende medier ger oss möjlighet att upprätthålla en hög cellviabiliteten samtidigt som man undviker användningen av en CO 2-kammare. För att mildra plattformen mot temperaturvariationer i rummet och att blockera ut ljus bakgrund rum, är en stor svart svepning draperad över hela mikroskopet / värmare installation Skapa en isolerad luftficka runt i systemet. Detta minskar avsevärt temperaturvariation och tillhörande temperatur-relaterade prov driva, men kräver förvärmning i 30 minuter innan montering provet.
6. Datainsamling, överföring och bildbehandling
Bilderna är tagna med en 60x 1,42 NA mål oljeimmersion (UPlanApo N, Olympus) eftersom den höga numeriska bländaröppningen (NA) avsevärt förbättrar upplösningen. För att skapa 3D konfokala bilder, skanning utförs av en snurrande skiva konfokala enhet (CSU-10, Yokagawa, Japan) som samtidigt använder> 800 konfokala platser att dramatiskt öka avsökningshastighet. För att gratulera dess hastighet, CSU-10 är ihopkopplad med en mycket känslig elektron-multiplicerar Charge Coupled enhet (EMCCD, iXon + 897, Andor Technologies, Irland) kamera för att möjliggöra snabb, svagt ljus bildbehandling vilket minskar både fotoblekning och fototoxicitet. Fluorescensen ljuskällan är en multi-våglängd ArKr ion gas laser (Innova 70C, sammanhängande, Santa Clara) där den önskade våglängden (488 nm) och laser effekt mätt precis innan mikroskop mål (<1 mW) väljs ut av en akusto- optisk avstämbara filter (AOTF), (Andor Technologies). För att ytterligare minska fotoblekning och förlänga Total Imaging tid, stängs AOTF snabbt (mikrosekunder) av laserstrålen varje gång kameran är inaktiv (10-20 ms), medan det nyligen förvärvade bilden levereras från CCD (15-30 ms exponering) till datorn. Det laserljus är kopplad till det snurrande skivan systemet med en 405/488/568/647 quad band dikroiskt spegel (Semrock, Rochester, NY). Fluorescens utsläppet filtreras med hjälp av en 525/50 bandpassfilter (Semrock) inuti ett filter hjul (Ludl elektroniska produkter, Hawthorne, NY) monterat Between den EMCCD kameran och konfokala spinning disk enhet. All hårdvara och förvärv, bland annat ett z-fas (Mad Stad Labs, Madison, WI), styrs av Andor iQ v1.8 programvara. För att maximera hastigheten på förvärvet till cirka 1,2-1,9 andra 3D bild stackar, beskär vi inspelningen region i EMCCD kamera ner till cell-parets närområdet. Dessutom på bekostnad av viss information i Z, kan en stor z-steg mellan 0,45-0,75 ìm användas för att påskynda förvärvet. Imaging Under dessa förhållanden kan pågå i upp till 6 timmar - med hjälp av kontinuerlig 20-60 minuters segment - med minimal fotoblekning. Sammanlagt upptar varje datasegment normalt 5-20 GB utrymme som tiotusentals bilder tas. För att underlätta transport och analys av stora datafiler, måste varje förvärv inställd på att brytas ner och exporteras som 1 Gb TIFF-segmenten bildfil med Andor iQ v1.8 programvara. Härifrån många utmärkta programpaket finns för bildanalys, såsom metamorfa, Volocity och ImageJ (vi rekommenderar att dess variation Fiji).
När två fluorescerande markörer som ska spåras, registrerar vi samtidigt dem båda utan att sakta ner förvärv med hjälp av ett "läge delad skärm." Båda markörer är upphetsad av två olika linjer ArKr laser på en gång (ofta 488 och 568 nm). Infogas direkt innan EMCCD kameran en bild splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, Storbritannien) som skiljer de två olika bilder. Varje bild är då oberoende filtreras med hjälp av fluorescens filter (Semrock) och förväntade sida vid sida på kameran samtidigt skapa "split-screen" effekt. Detta skulle kräva manuell beskärning och anpassning av bilder senare i bildbehandling.
7. Överväganden för bildbehandling och dataanalys
Vi utför vanligen bildanalys med Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) på Macintosh-datorer (Apple, Inc). Spinning disk laser konfokalmikroskopi bilder är först justeras i deras intensitet för att korrigera för fotoblekning, sedan deconvolved med Volocity. Intensitet mätningar och spårning av Gag puncta sker med Volocity Kvantifiering modulen. För bild ställer där rörelsen i förhållande till en förformade synapsen måste beräknas, är en automatisk spårning algoritm anställda som spårar synaptiska knappen hela sekvensen. Manuell inspektion av de områden av intresse definieras av autotracking programvaran måste utföras för att bekräfta att programvaran korrekt spårat det önskade objektet. För objekt där kontrasten med det omgivande objekt är för svag, kan manuell spårning utföras på en bildruta för bildruta basis. Den Volocity programpaket tillåter export av XYZ plats, volym och integrerad signal i den önskade objekt. Avståndet från synapsen och hastighet spårade objektet beräknas genom att normalisera rörelser till mitten av synaptiska knappen.
8. Representativa resultat
Inom 10 till 15 minuter att blanda en ska kunna visualisera hiv Gag-iGFP uttrycker Jurkat celler som ansluter sig till primär CD4 + T-celler. Imaging dessa konjugat kan man bedöma rörelser Gag puncta i infekterade celler samt i målceller efter synaspe. Man kan följa flödet av Gag-iGFP puncta in i målceller strax efter synapser bildas.
Discussion
Vi beskriver här en enkel metod för att visualisera överföring av hiv från cell-cell. Ny forskning från vårt laboratorium och andras antyder att detta kan vara det dominerande sättet att hiv sprids mellan T-celler. Den metod som beskrivs här använder en rekombinant form av hiv som kallas hiv Gag-iGFP, som bär på en genetiskt kodade grönt fluorescerande proteinet tag i kärnan proteinet, Gag. På grund av de höga nivåerna av GFP som produceras i varje virus partikel, möjliggör detta replikationskompetenta klon av hiv-forskare för att spåra enskilda viruspartiklar i realtid. Detta virus bör vara särskilt användbar i studier rörande montering och cell-cell överföring av HIV.
Överföringen av hiv genom cell-cell överföring är mycket effektiv. Under en tre timmars co-kultur, vi rutin ser viruset överförs till 20-30% av den primära T-celler som bedöms av flödescytometri. Liknande effektivitetsvinster är kvalitativt sett under levande cell imaging. Viralt infekterade T-celler att börja bilda synapser med oinfekterade primära T-celler nästan omedelbart efter inledandet av co-kultur. Intressant, inte alla primära T-celler är kapabla att interagera med HIV-infekterade Jurkat celler trots tvingas interaktion med laser pincett (opublicerade observationer, GM). HIV Gag-iGFP kommer utan tvekan att vara användbart för att bestämma T-cell delmängder som är mest mottagliga för cell-cell överföra, både in vitro och in vivo.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna översyn stöddes av National Institutes of Health bidrag, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Karriär Scientist Awards för BKC och av NSF Centrum för Biophotonics vetenskap och teknik, samarbetsavtal PHY012099 och en UCD Health System Research Award till TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J Exp Med. 199, 283-293 (2004).
- Hubner, W. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. J Virol. 81, 12596-12607 (2007).
- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
