Label-free In situ Imaging van Lignification in Plant celwanden

Summary

Een methode gebaseerd op confocale Raman microscopie wordt gepresenteerd die biedt label-free visualisatie van lignine in plantaardige celwanden en vergelijking van lignification in verschillende weefsels, monsters of soort.

Abstract

Aan de groeiende vraag naar energie veilig en efficiënt is een urgente mondiale uitdaging. Daarom heeft het onderzoek naar de productie van biobrandstoffen, dat wordt gezocht naar kosteneffectieve en duurzame oplossingen uitgegroeid tot een actueel en kritische taak. Lignocellulose biomassa is klaar om de primaire bron van biomassa voor de conversie naar vloeibare biobrandstoffen ^1-6 geworden. Echter, de weerspannigheid van deze plant celwand materialen om kosten-effectieve en efficiënte degradatie vormt een grote belemmering voor het gebruik ervan bij de productie van biobrandstoffen en chemicaliën ^4. In het bijzonder, lignine, een complex en onregelmatige poly-phenylpropanoid heteropolymeer, wordt problematisch om de na-oogst deconstructie van lignocellulose biomassa. Bijvoorbeeld in biomassa conversie voor biobrandstoffen, het remt versuikering in processen gericht op het produceren van eenvoudige suikers voor vergisting ^7. Het effectieve gebruik van plantaardige biomassa voor industriële doeleinden is in feite grotendeels afhankelijk van de mate waarin de plant celwand is lignified. Het verwijderen van lignine is een kostbare en beperkende factor ⁸ en lignine is derhalve een sleutelelement het kweken van planten en genetische manipulatie doel om celwand conversie te verbeteren.

Analytische instrumenten die de accurate snelle karakterisering van lignification van plantaardige celwanden vergunning steeds belangrijker geworden voor het beoordelen van een groot aantal broedpopulaties. Extractieve procedures voor de isolatie van inheemse componenten zoals lignine zijn onvermijdelijk destructief, waardoor over belangrijke chemische en structurele wijzigingen ^9-11. Analytisch chemische in-situ methoden zijn dus van onschatbare waarde tools voor de samenstelling en structurele karakterisatie van lignocellulose materialen. Raman microscopie is een techniek die is gebaseerd op inelastische of Raman verstrooiing van monochromatisch licht, net als dat van een laser, waarbij de verschuiving in energie van de laser fotonen is gerelateerd aan de moleculaire vibraties en presenteert een intrinsieke label-free moleculaire "vingerafdruk" van het monster . Raman microscopie kan het zich veroorloven niet-destructieve en relatief goedkope metingen met een minimale monstervoorbereiding, het geven van inzicht in chemische samenstelling en de moleculaire structuur in een dicht bij de oorspronkelijke toestand. Chemische beeldvorming door confocale Raman microscopie is al eerder gebruikt voor de visualisatie van de ruimtelijke verdeling van cellulose en lignine in het hout celwanden ^12-14. Op basis van deze eerdere resultaten, hebben wij onlangs deze methode om lignification vergelijken in wild-type en lignine-deficiënte transgene Populus trichocarpa (zwart Cottonwood) steel hout ^15. Het analyseren van de lignine Raman bands ^16,17 in het spectrale gebied tussen 1600 en 1700 cm ^-1, lignine signaal intensiteit en lokalisatie in kaart gebracht in situ. Onze aanpak gevisualiseerd verschillen in de lignine-gehalte, lokalisatie, en chemische samenstelling. Recentelijk hebben we aangetoond Raman beeldvorming van de celwand polymeren in Arabidopsis thaliana met een laterale resolutie die is sub-um ^18. Hier wordt deze methode gepresenteerd bieden visualisatie van lignine in plantaardige celwanden en vergelijking van lignification in verschillende weefsels, monsters of species zonder vlekken of de etikettering van de weefsels.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Monteer de gehydrateerde plant monster, bijv. populier stam hout of Arabidopsis thaliana stam, in de microtoom.
2. Snijd dunne secties (meestal 20 urn dik) van de inheemse weefsel.
3. Breng de plant sectie op een glazen microscoopglaasje.
4. Geniet van de plant sectie in D ₂ O en bedek het met een glazen deksel slip, dat is verzegeld op de microscoop dia naar verdamping van D ₂ O. te voorkomen De plant gedeelte is nu klaar voor de beeldvorming of het kan worden opgeslagen voor toekomstig gebruik.

2. Voorbeeld meting

1. Van toepassing zijn immersie olie aan de microscoop doelstelling en / of het dekglas.
2. Plaats en zet de microscoop dia op het piëzo-elektrische scan fase van de microscoop, met het deksel slip tegenover de microscoop doelstelling.
3. Bekijk het monster door de dekglas behulp van een hoge numerieke apertuur immersie microscoop doelstelling (100x, NA = 1,40) en zoek het monster gebied van belang.
4. Na het uitschakelen van alle andere laboratorium en microscoop lichtbronnen, positie-opgelost miscrospetroscopie metingen worden uitgevoerd door zich te richten bandpass-gefilterd monochromatisch groen licht (λ = 532 nm) van een cw-laser op het monster met een typisch vermogen van 10 tot 30 mW ( zie figuur 1 voor een schematische weergave van de setup). Autofluorescentie kan optreden in sommige monsters, die nuttig kan metingen te verbieden, in welk geval excitatie met langere golflengte laser licht kan raadzaam zijn.
5. De back-verstrooide Stokes Raman-verschoven licht wordt verzameld door de microscoop doelstelling, passeert een dichroïde spiegel, een gaatje, dat dient als een ruimtelijk filter in de confocale setup, en een longpass filter, en richt zich in de gleuf van een rooster spectrometer, waar het licht spectraal is verspreid en gedetecteerd door een gekoelde CCD-camera, wat een Raman spectrum. Een Raman spectrum van populierenhout is weergegeven in figuur 2, met karakteristieke lignine bands in het spectrale gebied tussen 1600 en 1700 cm ^-1.
6. Voor chemische beeldvorming en visualisatie van de ruimtelijke spreiding lignine, is een twee-dimensionale spectrale kaart verkregen door het scannen van de raster monster door de laser scherp met de piëzo-elektrische scan podium en het opnemen van een Raman spectrum voor elk monster positie. Drie-dimensionale spectrale kaarten kunnen worden gegenereerd door het stapelen van twee-dimensionale kaarten voor dat de laser zich achtereenvolgens was stapte langs de z-richting.

3. Data Analysis

1. Voor chemische beeldvorming en lignine visualisatie, is de verzamelde gegevens geanalyseerd met behulp van MATLAB (The MathWorks, versie 7.7). De gegevens worden gerangschikt in een drie-dimensionale hyperspectrale kubus, die is samengesteld uit de twee ruimtelijke dimensies en een derde dimensie voor de spectrale signalen.
2. Voor de lignine analyse wordt de spectrale gebied tussen 1550 en 1700 cm ^-1 overwogen (zie figuur 2). De ruimtelijke verdeling van lignine wordt gevisualiseerd door de integratie van de intensiteit van 1550 tot 1700 cm ^-1 van de baseline-gecorrigeerde spectra (zie figuur 3). Als alternatief voor baseline correctie, kan de tweede afgeleide spectra worden berekend en de tweede afgeleide pieken gebruikt voor analyse.
3. Lignine lokalisatie en chemie, vooral met betrekking tot coniferaldehyde en coniferyl alcohol delen, kan verder worden geanalyseerd door het evalueren van de oppervlakte onder gemonteerd Gaussiaanse pieken van de drie banden gevonden tussen 1600 en 1700 cm ^-1 (zie kader van figuur 2 en Refs 15. - 17).
4. Intensiteit van normalisering tussen verschillende spectrale kaarten is uitgevoerd met behulp van als referentie de piek hoogte van de extrinsieke OD zich uitstrekt band rond 2500 cm ^-1 in de gemiddelde lumen spectra, die worden verkregen door k-means clustering classificatie. Dit is van cruciaal belang en maakt het mogelijk om lignine signaal intensiteit te vergelijken tussen de verschillende metingen, weefsels, monsters en soorten.

4. Representatieve resultaten

Een vertegenwoordiger Raman spectrum van de populier (Populus angustifolia) stam hout is weergegeven in figuur 2. Kenmerkend lignine bands zijn te vinden in het spectrale gebied tussen 1600 en 1700 cm ^-1. Als voorbeeld wordt de ruimtelijke verdeling van lignine in een populierenhout doorsnede weergegeven in figuur 3. In vergelijking met het zichtbare beeld, morfologisch verschillende celwand regio's worden duidelijk te onderscheiden zijn te wijten aan verschillende lignine intensiteit van het signaal. Hoge lignine intensiteit van het signaal is waargenomen in de cel hoeken (CC) en, iets minder, in de verbinding midden lamellen (CML). Lager, maar niet niet-substantiële, hoeveelheden lignine in acht worden genomen binnen de S2 muur laag van de vezels. Variabiliteit van lignine signaal intensiteit is in zekere mate aanwezig binnen de CC, CML en S2, in het bijzonder van vezel tot vezel. De laterale ruimtelijke resolutie in onze metingen is ~ 300 nm. De kwaliteit van de gegevens leent zich goed voor lignification vergelijken tussenmonsters en verder te ontleden lignine chemie ^15.

Figuur 1: Een schematische weergave van de instrumentele setup BP:. Banddoorlaatfilter, DM: dichroïsche spiegel, PH: pinhole, LP: longpass filter.

Figuur 2: Een vertegenwoordiger Raman spectrum van de populier (Populus angustifolia) stam hout opgenomen in D ₂ O. De gemarkeerde spectrale gebied (zie ook de inzet), markeert het spectrale gebied met drie pieken die specifiek toe te schrijven aan lignine.

Figuur 3: Raman lignine beeld (bodem) van een populierenhout doorsnede (top: zichtbaar beeld), verkregen door het integreren van de Raman-signaal intensiteit van 1.550 tot 1.700 cm ^-1.

Discussion

Lignocellulose materialen zijn hiërarchisch en heterogeen met betrekking tot zowel de structuur en samenstelling. Voor een diepgaande karakterisering analytische hulpmiddelen die chemische overgevoeligheid, ruimtelijke resolutie, en die inzicht geven in deze materialen in de inheemse context wenselijk zijn. De beschreven werkwijze biedt de visualisatie van lignine en vergelijking van lignification van lignocellulose plantaardige biomassa met ruimtelijke resolutie die is sub-micrometer, zonder vlekken of de etikettering van de monsters in een dicht bij de oorspronkelijke toestand. Het vereist een minimale monstervoorbereiding en de metingen zijn niet-destructief en relatief goedkoop. De methode kan nuttig zijn bij het evalueren van lignification geassocieerd met een groot aantal van de broedpopulaties. In aanvulling op lignine, de Raman-spectra bevatten ook spectrale vingerafdrukken van cellulose en hemicellulose het, die kan worden opgenomen in een uitgebreide analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope slides
cover slips
D2O
nail polish
immersion oil
tweezers
pointed brush
microtome
confocal Raman microscope