Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Published: November 26, 2010 doi: 10.3791/2077
* These authors contributed equally

Summary

Tümör hücrelerinin T hücre etkileşimi analizi için deneysel bir akciğer metastazı ve CTL immünoterapi fare modeli

Abstract

Deneysel metastaz fare modeli basit ve fizyolojik ilgili henüz metastaz modeli. Tümör hücrelerinin fare kuyruğu damarlar içine (iv) damar içine enjekte ve tümör hücre spontan metastaz son adımları benzeyen, böylece, akciğerlerde kolonize: distal organlarda kan dolaşımı, ekstravazasyonu ve sömürgeciliğin yaşam. Metastatik tümör distal organ yılında kurulan: tedavilerin hedef genellikle metastaz bitiş noktası bu yana tedavi edici bir açıdan bakıldığında, deneysel metastaz modeli en basit ve ideal bir model. Bu modelde, tümör hücrelerinin fare kuyruğu damarlar içine iv enjekte edilir ve akciğerlerde kolonize ve büyümeye izin. Tümör spesifik CTL sonra iv metastaz taşıyan fare içine enjekte edilir. Akciğer metastazları sayısını ve boyutunu enjekte edilecek tümör hücrelerinin sayısı ve tümör büyümesini zaman kontrol edilebilir. Bu nedenle, çeşitli aşamalarında metastaz, geniş metastaz minimal metastaz modellenmiş olabilir. Akciğer metastazı, böylece daha kolay görsel gözlem ve miktar sağlayarak, mürekkep ile enflasyon analiz edilir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Deneysel metastaz Fare Modeli

  1. Gün önce tümör hücresi enjeksiyonları, 1'e kadar tohum T75 balon x 10 7 CMS4 Met hücreleri RPMI orta hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için% 10 serum içeren 10 ml. 37 o gece inkübe ° C
  2. Enjeksiyon gününde, orta kaldırmak ve hücreler PBS ile bir kez yıkayın, sonra 37 0.05% tripsin-EDTA ile tümör hücrelerinin hasat ° C 5 dakika. 10 ml% 10 serum içeren RPMI orta ile reaksiyon durdurun. Konik bir tüp hücreleri aktarın.
  3. Oda sıcaklığında 3 dakika 1300 rpm'de Sorvall Legend RT santrifüj hücreleri aşağı spin. Süpernatantı. Yıkamak için 10 ml taze 1X HBSS hücrelerin yeniden süspanse edin, sonra tekrar aşağı spin ve aynı şekilde tekrar süspansiyon haline getirin.
  4. Bir hemasitometre tümör hücreleri saymak. Böylece her enjeksiyon için gerekli hücrelerin toplam hacmi 100 mcL yeniden süspanse, HBSS hücrelerin sulandırınız.
  5. Kuyruk ven genişletmek için ılık suya batırılmış beher 6-8 haftalık BALB / c farelerde ısıtın. Fare, bankta bir kuyruk ven süzgeç koyun. 100 mcL tümör hücrelerinin lateral kuyruk damar içine enjekte etmek için bir mikroenjektör kullanın. Bulaşmasını önlemek için aseptik teknik kullanın. Kanama durduktan kadar enjeksiyondan sonra enjeksiyon yerinde hafif bir basınç uygulayın.
  6. Fare kafesine geri dönün ve istenilen aşamada tümör büyümesine izin.

2. Sitotoksik T-Lenfosit (KVK) Kabul edilmiş Transferi İmmünoterapi

  1. Transfer gününde, saflaştırılmış T-lenfositleri sitotoksik ya da CTL, metinde açıklandığı gibi hazırlanmış tekrar süspansiyon pipet ve aşağı yukarı. Hacmi daha fazla tüpün 2 / 3 'ünden fazla izin vermeyen, tüm hücreleri bir plaka 15 ml konik tüp transferi.
  2. Steril bir Pasteur pipeti konik tüp içine yerleştirin ve toplam hacmi 14 ml yaklaştığında kadar hücrelerin altında, Lenfosit Ayırma, Orta veya LSM yatıyordu.
  3. Katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun. Oda sıcaklığında 20 dakika 2000 rpm'de santrifüjleyin. Sonra rotor iplik yavaş fren kullanmayın.
  4. Yeni bir 15 ml konik tüp CTL'lerin aktarın. Yıkamak için yaklaşık 10 ml hacmi HBSS ekleyin.
  5. Hücreleri saymak. Oda sıcaklığında 5 dakika 1300 rpm'de Spin. Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 mcL tutarak, enjeksiyon için gerekli hücre yoğunluğu HBSS tekrar
  6. CTL'lerin Tümör taşıyan farelere enjekte etmek için bu video daha önce görüldüğü gibi aynı kuyruk enjeksiyon tekniği kullanın.
  7. Fare kafesine geri dönün ve CTL tümör ile etkileşim kurmak için izin. Fareler genellikle 14-21 gün CTL tedavi sonra analiz için feda.

3. Akciğer metastaz, Görselleştirme

  1. Akciğer metastazları görselleştirmek için, plastik bir yönetim kurulu sırtını bir kurban fare yerleştirin. Trakea engelsiz erişim sağlamak için bacaklarını Pin. % 70 etanol ile ventral taraf püskürtün.
  2. , Orta karın itibaren, göğüs kafesi, tükürük bezlerinin doğru, orta hat boyunca kesme, ve makas kullanın. Trakea Açığa. Trakea çevre dokulara çıkarmak için forseps kullanın.
  3. Trakea altında 200 mcL pipet geçirin. Tek elle Holding ucu hafifçe vücuttan trakea yukarı kaldırın ve uzak.
  4. Platform 180 ° döndür. Trakea yoluyla ciğerlerine Hindistan Mürekkep enjekte etmek için 50 ml şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar mürekkep ile akciğerler tamamen şişirmek.
  5. Trakea kesmek için makas kullanın. Slayt, akciğerlerin altında forseps bir çift ve onları farenin dışarı çıkarın. Akciğerlerde su 1L beher kısaca durulayın.
  6. Kimyasal bir davlumbaz, Fekete çözüm 5 ml cam sintilasyon içeren bir flakon için akciğerlere transfer. Tümör dokusu, birkaç dakika sonra siyah akciğerler üzerindeki beyaz nodüller olarak ortaya çıkacaktır. Tümörler şimdi sayılır ve süresiz Fekete çözümü olarak saklanabilir.

4. Görüntülenmiştir Akciğerler Temsilcilik Metastazları

  1. Burada, meme karsinom hücre hattı 4T1 ile enjekte edilen farelerden alınan akciğerlerin tümörler gösteren beyaz lekeler gösteriyor. Bir IRF8 dominant-negatif mutant K79E ile transfekte 4T1 hücreleri enjekte edildi Fare, tümör hücrelerinin gelişmiş metastatik potansiyelini gösteriyor.
  2. Bu görüntüler CTL evlatlık transfer immünoterapi etkinliği bir histolojik analiz göstermektedir. Tümör taşıyan farelere enjekte edildi sarı oklar (A) ile gösterilir, 6 gün sonra birden fazla tümörler gösterdi. Tümör spesifik T hücreleri ile enjekte edilen farelerin, diğer taraftan, tümörler (B) bir azalma gösterdi.
  3. Aynı deneyde, Hindistan mürekkep tedavi CTL evlatlık transferi etkinliğini ölçmek için basit bir yol verir. Burada, tümör taşıyan akciğerler üzerindeki beyaz tümör nodülü CTL evlatlık transferi başarıyla geçirmiş ve nodüller sayma akciğerler açıkça ayırt bir dereceye kadar izin verirhistoloji ile kantitatif mümkün değildir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1
Şekil 1. Deneysel deneysel tümör metastazı ve CTL adaptif transfer immünoterapi fare modeli şeması. Kırmızı nokta, tümör hücreleri ve yeşil noktalar CTL'lerin göstermektedir.

Şekil 2
Şekil 2 IRF8 fonksiyonunun bozulması, tümör hücrelerinin metastatik potansiyeli geliştirilmiş . Fare meme karsinom hücre hattı 4T1 stably vektör (4T1.Vector) veya vektör bir IRF8 dominant-negatif mutant K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16) ifade ile transfekte edildi. Tümör hücreleri fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Tümör taşıyan akciğerleri tümör nodülü görselleştirmek Türkiye mürekkep ile şişirildi. Tümör nodüller kolaylıkla siyah akciğer dokusunda arka plan üzerinde beyaz lekeler olarak görülür.

Şekil 3
Şekil 3 CTL evlatlık transfer immünoterapi etkinliğini histolojik analiz. Fare sarkom hücre hattı CMS4-met fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Üç gün sonra, tuzlu su (A) veya tümör-spesifik T hücrelerinin (B) Tümör taşıyan farelere enjekte edildi. Akciğerler geleneksel H & E histolojik boyama tarafından CTL tedavi altı gün sonra incelendi. Tümör nodüller oklarla gösterilir.

Şekil 4
Şekil 4 Hindistan mürekkep enflasyon tümör nodülleri Görselleştirme. Fare sarkom hücre hattı CMS4-met fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Üç gün sonra, serum fizyolojik (kontrol) veya tümör-spesifik T hücreleri (CTL) Tümör taşıyan farelere enjekte edildi. Akciğerler, ondört gün CTL tedavi sonra incelendi. Tümör nodülü olan beyaz noktalar, kolay CTL tedavinin etkinliğinin ölçümü için izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Fare Ulusal Kanser Enstitüsü (Friderick MD) alınan ve Georgia hayvan tesis Tıp Koleji alır. Deneyler ve bakım / refah federal düzenlemeler ile anlaşma ve Georgia IACUC komitesinin Tıp Koleji tarafından onaylanmış bir protokol.

Acknowledgments

Ulusal Sağlık Enstitüleri (KL için CA133085) ve Amerikan Kanser Derneği (KL RSG-09-209-01-TBG) hibe ile desteklenir.

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

  1. Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask.
  2. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water.
  3. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture.
  4. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

  1. Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle.
  2. Add 150ml distilled water
  3. Add 50ml formaldehyde
  4. Add 25ml glacial acidic acid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol. 167, (8), 4286-4292 (2001).
  2. Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol. 171, (5), 2402-2412 (2003).
  3. Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol. 176, (6), 3374-3382 (2006).
  4. Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer. 122, (2), 350-362 (2008).
  5. Pages, F., Berger, A., Camus, M. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, (25), 2654-2666 (2005).
  6. Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313, (5795), 1960-194 (2006).
  7. Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut. 54, (5), 661-665 (2005).
  8. Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research. 69, (6), 2685-2693 (2009).
  9. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol. 23, (10), 2346-2357 (2005).
  10. Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research. 70, (1), 68-77 (2010).
  11. Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research. 68, (8), 2561-2563 (2008).
  12. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews. 9, (4), 274-284 (2009).
  13. Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery. 22, (1-2), 1-2 (2005).
  14. Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res. 13, (17), 5202-5210 (2007).
  15. Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol. 179, (7), 4775-4782 (2007).
  16. Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research. 67, (7), 3301-3309 (2007).
  17. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute. 36, (4), 641-645 (1966).
Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model. J. Vis. Exp. (45), e2077, doi:10.3791/2077 (2010).More

Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model. J. Vis. Exp. (45), e2077, doi:10.3791/2077 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter