实验转移和CTL过继转移免疫小鼠模型

Published: November 26, 2010 doi: 10.3791/2077

Mary Zimmerman*¹, Xiaolin Hu*¹, Kebin Liu¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Georgia

* These authors contributed equally

Summary

一个实验性肺转移和CTL免疫小鼠模型的肿瘤细胞- T细胞相互作用分析

Abstract

实验转移小鼠模型是一个简单的，但有关生理转移模型。肿瘤细胞静脉注射（四）为小鼠尾静脉和殖民，从而在肺部，类似肿瘤细胞自发转移的最后步骤：在流通领域，外渗及远端器官的殖民化的生存。从治疗的观点来看，实验转移模型是最简单和理想的模式，自疗法的目标往往是：建立在远端器官的转移瘤的转移终点。在此模型中，肿瘤细胞注射四到小鼠尾静脉，并允许在肺部进行殖民和增长。然后注入肿瘤特异性CTL转移轴承鼠标第四。肺转移的数量和大小，可以控制被注入肿瘤细胞的数量和肿瘤生长的时间。因此，各个阶段的转移，从最小的转移到全身广泛转移，可为蓝本。肺转移，从而允许更容易直观地观察和定量分析与油墨的通货膨胀。

Protocol

1。实验转移小鼠模型

前一天的肿瘤细胞的注射剂，种子之一T75容量瓶中，用高达1 × ¹⁰ 7 CMS4了10 mL的RPMI培养基中含有10％的血清，以获得快速增长的肿瘤细胞中的细胞。过夜孵育在37 ° C。
在注射当天，去除培养基，用PBS冲洗细胞一次，然后用0.05％胰酶EDTA收获肿瘤细胞在37 ° C为5分钟。停止与10 mL的RPMI培养基中含有10％血清中反应。细胞转移到锥形管。
分拆为3分钟，在室温下在Sorvall传奇RT离心机在1300 rpm的细胞。去除上清。重悬在10毫升的新鲜1X的HBSS洗细胞，然后降速再次重悬在以同样的方式。
血球计数肿瘤细胞。在HBSS中稀释的细胞，所以，每次注射所需的细胞悬浮在总体积100μL。
在温水中浸泡一个烧杯的尾静脉扩张，暖在6-8周龄BALB / c小鼠。鼠标放置在一个板凳上的尾静脉限位。使用microsyringe尾静脉注入100μL的肿瘤细胞。使用无菌技术操作，以避免感染。注射后，适用于注射部位轻微的压力，直到出血停止。
返回鼠标笼子，使肿瘤生长所需的阶段。

2。细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的过继转移免疫

在转移的当天，吸管上下以重悬纯化的细胞毒性T淋巴细胞，或CTL的准备，如文中所述，。所有的细胞从一个板块转移到15 mL锥形管，不要让音量超过超过2 / 3管。
无菌巴斯德吸管插入锥管和奠定下细胞的淋巴细胞分离液，或LSM，直到总量接近14毫升。
要小心，不要去打扰层。在室温下20分钟在2000转离心。不要使用制动快后慢，旋转转子。
转移到一个新的15 mL锥形管的CTL。容积约10毫升加入HBSS洗。
细胞计数。在室温下5分钟1300转离心。重悬在HBSS中所需的细胞密度注射，每次注射总量保持在100μL。
前面看到的那样在这个视频中注入荷瘤小鼠的CTL，使用相同的尾部注射技术。
返回鼠标笼子，让CTL的互动与肿瘤。老鼠通常牺牲的CTL治疗后14-21天进行分析。

3。肺转移的可视化

为了直观肺转移，一个牺牲的鼠标在其上的一个泡沫塑料板的背面。 PIN的腿，以确保通畅进入气管。喷雾用70％乙醇的腹侧方。
从中旬腹部开始，用剪刀沿中线切，通过胸腔，向唾液腺。公开气管。使用镊子，以消除气管周围的组织。
线程下面的气管200μL枪头。一只手握住一角，轻轻气管和远离身体。
平台旋转180 °。使用50 ml注射器注入印度墨水肺部通过气管。完全与油墨的肺部膨胀，直到你感到强烈的抵触情绪。
用剪刀剪开气管。肺部下一双镊子滑动，并解除他们的鼠标。简要1L烧杯中的水冲洗肺部。
在化学通风柜，肺部转移到闪烁的玻璃小瓶含5毫升的Fekete的解决方案。几分钟后，肿瘤组织会出现白色上黑色的肺部结节。肿瘤，现在可以计算和存储在无限期的Fekete的解决方案。

4。在可视化的肺代表转移

在这里，从与乳腺癌细胞株4T1注入小鼠的肺部显示白色斑点，说明肿瘤。一个IRF8显性负突变K79E的转染4T1细胞注射的小鼠肿瘤细胞的增强的转移潜能。
这些图像显示CTL过继转移免疫组织学疗效分析。注射用生理盐水荷瘤小鼠表现为多发性肿瘤6天后，黄色箭头（一）表示。另一方面，表现出与肿瘤特异性T细胞注入小鼠体内，减少了肿瘤（二）。
在相同的实验，墨汁治疗提供了一个简单的方法来衡量CTL过继转移的疗效。在这里，白荷瘤肺肿瘤结节明显区别于他们已成功地进行CTL过继转移，结节计数肺部允许学位定量不可能与组织学。

5。代表性的成果

图1为实验肿瘤的转移和CTL的适应性转移免疫小鼠模型的试验计划。红色圆点表示肿瘤细胞和绿色圆点表示的CTL。

图2中断IRF8功能增强对肿瘤细胞的转移潜能。稳定转染的小鼠乳腺癌细胞株4T1载体（4T1.Vector）或向量表示一个IRF8显性负突变K79E（4T1.IRF8K79E）（15，16）。鼠标横向尾静脉注射四到肿瘤细胞。荷瘤肺膨胀与印度墨水可视肿瘤结节。肿瘤结节很容易被看作是黑色的肺组织背景上的白色斑点。

图3。CTL过继转移免疫组织学疗效分析。鼠标横向尾静脉注入小鼠肉瘤细胞株CMS4 - Met的第四。三天后，生理盐水（A）或肿瘤特异性T细胞（B）分别注入荷瘤小鼠。常规H＆E染色组织学染色CTL治疗后6天，肺部进行了分析。肿瘤结节是由箭头指示。

图4。墨汁通胀的肿瘤结节的可视化。鼠标横向尾静脉注入小鼠肉瘤细胞株CMS4 - Met的第四。三天后，生理盐水（对照）或肿瘤特异性T细胞（+ CTL）分别注入荷瘤小鼠。的CTL治疗14天后，肺部进行了分析。白点，这是肿瘤结节，允许容易量化的CTL治疗的疗效。

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Disclosures

小鼠购自美国国家癌症研究所（Friderick，MD）和住在医学院格鲁吉亚动物设施。实验和关怀/福利协议联邦法规和医学院格鲁吉亚IACUC委员会批准的协议。

Acknowledgments

由美国国立卫生研究院（CA133085吉隆坡）和美国癌症协会的资助（RSG - 09 - 209 - 01 - TBG的吉隆坡）支持。

Materials

Solutions:
India Ink Solution (17):
Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.
Fekete's Solution (17):
Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.
Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid