Внутривенно микроинъекции данио рерио Личинки по изучению Острое повреждение почек

Summary

Мы опишем технику microinjecting аминогликозидов, гентамицин, в 2-х дней после fetilization (DPF), данио личинки, чтобы вызвать острое повреждение почек (АКИ). Мы также опишем метод целом иммуногистохимии крепления, пластиковые вложения и секционирования данио личинки визуализировать повреждения AKI опосредованной.

Abstract

В этом видео статье мы расскажем данио модель AKI использованием гентамицин как nephrotoxicant. Техника состоит из внутривенного микроинъекций на 2 денье рыбок данио. Эта техника представляет собой эффективный и быстрый способ доставки растворимых веществ в кровь личинки данио рерио, что позволяет инъекции 15-20 рыбы в час. В дополнение к AKI исследования, это микроинъекции методика может также использоваться для других типов экспериментальных исследований, такие как ангиография. Мы предоставляем подробный протокол технику оборудование, необходимое для визуальной мер снижения функции почек. Кроме того, мы также демонстрируют процесс фиксации, целые иммуногистохимии крепление с маркером почек трубочку, пластик вложения и секционирования личиночной рыбок данио. Мы показываем, что личинки данио вводили гентамицин показать морфологические особенности в соответствии с АКИ: отек, потеря клеточной полярности в проксимальных канальцев эпителиальных клеток, и морфологические нарушения канальцев.

Protocol

Часть из следующих протокол основан на опубликованных методов сообщает (Hentschel и соавт. 2005) и (Вайнштейн и соавт. 1995) с небольшими изменениями.

Часть 1: Микроинъекции

Созданная в заранее для микроинъекции

• Рыбы вводится через 2 дня после оплодотворения (DPF). Таким образом, взрослые разводят рыбок данио 3 ночи до планируемого эксперимента. Сбор эмбрионов и поместить их в чашку Петри с E3 воды (5 мМ NaCl, 0.17mM KCl, CaCl ₂ 0,33 мм, 0,33 мм MgSO ₄₎ на 28,5 ° C. В конце первого дня удалить мертвые эмбрионы из чашки Петри и отдельных эмбрионов чтобы Есть 80-100 эмбрионов в чашке Петри.
• Подготовка стеклянной иглы вытягиванием из капилляров (4 дюймов в длину, 0,63 / 0,20 OD / ID миллиметр (мм) R-6 Custom стеклянных трубок Драммонд научной компании, Broomall, PA 9-000-3000) с электродом съемника. Диаметр кончика должна быть 10-20 мкм. Под рассекает микроскопа (Leica S6E), с постоянным маркером привлечь около 10 1мм линий вдоль иглы, с помощью линейки, и хранить иглы в большой чашке Петри на глиняных рампы.
• Подготовка проведения пипетки: Огонь-польский кончик тонкостенных боросиликатного стекла капиллярная трубка (152 мм, 1 / 0.75 OD / ID мм TW100-6, инструменты Всемирного Precision, Inc), в пламени горелки Бунзена, пока внутренний диаметр наконечник 0,4-0,5 мм. Такое измерение позволяет хорошее сцепление желточного мешка личинки данио 2 денье. Держите один конец кусок стеклянного капилляра с помощью длинных щипцов, и тепла противоположного кончик капилляра с горелкой Бунзена, ставя ее вертикально над голубой внутреннего конуса пламени, жаркое, в течение 1-2 секунд, прокат его получить даже расплава. Повторите это несколько раз, затем изучить капиллярной под микроскопом, на сцене микрометра (Уорд 94 Вт 9910). Это очень важный шаг, возможно, будет необходимо стрелять-польский несколько пипеток холдинга и выберите подходящий размер спустя, когда Вы манипулируете личинок. Если вы внимательны, один холдинг пипетки длится в течение нескольких сеансов микроинъекции.
• Заполните ручной насос микрошприца (ММП, Всемирный точных приборов, Inc) с минеральным маслом, следуя инструкциям производителя. Держатель пипетки вставляется в джойстик манипулятора (Narishige, MN-151), связанные с магнитными подставкой (Narishige, MN 151) к железной пластине (Narishige, IP).

Микроинъекция

• Подготовка 20 мкл инъекции смеси. 2.4μl гентамицин (Sigma-Aldrich G8648, 50мг/мл в солевом растворе) и 17.6μl 10-кДа Люцифер желтый декстрана (Invitrogen D1825 (1mg/ml в солевой раствор) в контрольных рыб гентамицин заменяется раствором соли. флуоресцентные декстрана (различные цвета могут быть использованы) достаточно проверить точность впрыска и выберите личинки, которые были введены с nephrotoxicant.
• Подготовка 2 30-мм чашки Петри с 2 мл минерального масла для размещения смеси впрыском и смеси под контроль, чтобы предотвратить испарение решений.
• Подготовка наркозом: 400 мг tricaine порошка (этил-м-аминобензоат метансульфонат СИГМА-5040) 97,7 мл ДД воды, 2,1 мл 1М Трис (рН 9). Отрегулируйте до рН 7. Хранить исходный раствор в холодильнике, в аликвоты 4,2 мл. Для использования tricaine в качестве анестезирующего средства разбавления 4,2 мл tricaine маточного раствора в 100 мл воды E3 (Уэстерфилд-1993) и оставить при комнатной температуре.

Следующие шаги выполняются под микроскопом рассекает

• Вручную удалите любые chorions оставшиеся с мелкими щипцов и обезболить данио передачи их в чашку Петри с tricaine нагревают при комнатной температуре. Данио рерио должны подвергаться tricaine по крайней мере 15 минут до начала микроинъекций.
• Открытое кончик инъекционной иглой использованием лезвия бритвы (VWR научно 55411-050). Держите лезвие под небольшим углом, чтобы создать конических и сократить кончик таким образом, чтобы получить чаевые открытие около 10-20 мкм диаметром.
• Включите питание, вакуумные и воздушные поставки микроинъекции аппарата (Всемирный точных приборов Inc, PV820 пневматический picopump). Вставьте иглу в иглодержатель установлен на микроманипулятора и наклона базы (Word Precision Instruments, Inc, модель M3301R, ТБ-1).
• Для заполнения иглы, место капли (10 мкл) раствора для инъекций в 30 мм чашки Петри заполнены минеральным маслом (Fisher химических веществ, 0121-1). Поверните ручной микроманипулятора таким образом, чтобы погрузить кончик иглы в каплю раствора, установить picopump "держать / выход" в положение "вентиляция" ("выход" приравнивается к вакуума на PV820), и заполнить иглу, потянув Решение через иглы. Это займет несколько минут, если решение попадает в иглу слишком быстро,это означает, что диаметр кончика слишком большой, и инъекции не будет точно. После игле заполняется, установить picopump до "держать" ("держать" приравнивает вводить на PV820).
• Для калибровки иглы, набор picopump "закрытых / приурочен" в положение "закрытого", нажмите педаль для выполнения иглу, и записать время, которое требуется (в секундах) для мениска, чтобы попасть из одного маркировки на следующий (1 мм общая дистанция). Повторите 3 раза, принять среднее время (в секундах), и разделить значение на 30 (объем в nanoliters (п), соответствующие 1 мм линейное расстояние), чтобы определить количество миллисекунд, необходимое для доставки 1 NL решения. Отрегулируйте ручку диапазон период к этому числу, и двигаться "закрытых / приурочен" перейти к "приурочен". Теперь picopump установлен доставить 1nl импульс решению.
• Удалить блюдо минеральное масло и положение чашки Петри с личинками под микроскопом. Группа рыбы в центр чашки Петри и фокус.
• Место проведения пипетки в ручной насос микрошприца (ММП, инструменты Всемирного точности) на противоположной стороне microinjector, заранее его кончик в чашке Петри, а в плоскости фокуса микроскопа. Согните его с довольно небольшим углом, так что самый кончик пипетки проведения соприкасается нижней части чашки Петри и близка к горизонтальной. Убедитесь, что не иметь никаких пузырьков воздуха в системе, которая может привести к замедлению времени реакции и снижение точности ММП.
• Изменение большем увеличении на микроскоп и использования сверхтонкого ресниц с ручкой (Тед Пелла 113) в положение личиночной стороны спины рыбы вниз с желтком очень близко к проведению пипетки. Держите личинок рыб, высасывая желток в холдинг пипетки, поворачивая против часовой стрелки микрометра привод управления ручным насосом микрошприца. Будьте осторожны, не свою очередь микрометр слишком далеко, как желток может лопнуть, если потянул слишком глубоко в проведении пипетки. Сосредоточьтесь на формирование общих кардинальных вен, которая лежит над желтка, как раз под перидермы и является местом очень высокий кровоток. С микроманипулятора инжекционного аппарата, руководство иглу в разработке общих кардинальных вен. Как правило, необходимо потянуть иглу немного назад после вставки, как общие кардинальные вены очень поверхностны. Inject 1nl решения, нажав педаль, затем отпустите личинок из холдинга пипетки и вернуть ее в эмбрион воды. Это очень важный шаг, особенно в первый раз, потому что она требует определенного количества практики в позиционировании рыбы и контроля всасывания и давления буровой установки. Если желток эмбрион правильно проводится при проведении пипетки, она не будет катиться, как игла входит.
• Чтобы убедиться в успехе микроинъекции, контролировать наличие Люцифер желтый декстрана в сердце данио под флуоресцентным микроскопом. Желтый Люцифер остается видимым в сердце в течение примерно 20 минут до рассеивания в кровеносную систему Если нефротоксических решение вводится правильно, в течение 2 часов инъекции вы увидите очень мало Люцифер желтый декстран оставаясь на месте инъекции. Если раствор вводят в желточного мешка, место Люцифера желтый декстран останется на месте инъекции. (Рис. 1). Вернуться рыбы на E3 среды.
• Через два дня после инъекции, личинки развиваются отек перикарда вследствие снижения почечной функции (рис. 2).

Часть 2: Фиксация и иммунофлюоресценции с Na ⁺ / K ⁺ АТФазы антител (α-6F)

• В 4 денье, положить от 10 до 15 личиночных данио в 4 мл стеклянные ампулы (Weathon, 225012) и установить их в 1 мл Дента (80% метанол 20% ДМСО) в течение 4 часов при комнатной температуре.
• Увлажняет эмбрионов в градуированных MeOH / PBT (PBS с 0,5% Tween20) серий, 75:25 50:50, 25:75, на 100% PBT, пипетки раствор, и добавив новые решения же флаконе (1 мл раствора на флакон), 20 минут в каждом решении. Личинки никогда не должны подвергаться воздействию воздуха, оставьте немного решение, охватывающее личинки при изменении решения.
• Удалить PBT и заменить 1 мл с блокирующим раствором (PBS с 1% ДМСО, 0,5% Tween20, 10% нормальной козьей сывороткой) в течение 3 часов при 4 ° С на nutator.
• Передача личинок в 2 мл отцентрифугировать. Удалите блокирующий сыворотки и заменить 300 мкл первичных антител в инкубационный раствор (PBS с 1% ДМСО, 0,5% Tween20, 2% нормальной козьей сывороткой) в течение ночи при температуре 4 ° С на nutator. Мы используем моноклональных Na ⁺ / K ⁺ АТФазы антител (α-6F, супернатант, связанными с развитием исследований Гибридома банка, штат Айова) в 1:25 разбавления
• Удаление первичного антитела и промыть 3 х 30 минут с инкубационный раствор при комнатной температуре.
• Инкубируйте с вторичными антителами (антимышиного Cy3, Джексон Immunoresearch Laboratories, Inc 155-165-003) разводят 1:500 в инкубационный раствор в течение 2 часов приРТ.
• Вымойте 3 х 30 минут с PBT.

Часть 3: Пластиковые вложение с JB-4

• Дегидрировать ткани через градуированные серии этанола (50%, 75%, 95%, 100% х 2), 10 минут на шаг.
• Подготовка инфильтрации решение: 25 мл JB-4 Вложение Решение (Polysciences 0226A) и 0.24g катализатора (Polysciences 02618). Это займет некоторое время для катализатора растворяться, около 20-30 минут. Раствор можно хранить при температуре 4 ° С до 1 месяца.
• Декантировать от 100% этанола и заменить его пластическое решение инфильтрации. Место флаконов 4 ° C на поворотное устройство и позволить проникновение продолжить, пока личинки опускаются на дно стакана флаконе. Этот процесс обычно занимает около 30 минут.
• Вложение протокол: Место пластиковый лоток чашку литья (Polysciences, Inc 16643A) под рассекает микроскопом. Передача личинками, наряду с инфильтрацией решение для покрытия, в чашки. Пластиковый материал, вложение подготовлен в трубочку пластик. Мы обычно вставлять 4-5 рыбы за один раз, одну рыбу для каждой чашки. Подготовка 5-6 мл вложение пластиковые (1,2 мл вложение решение для каждой чашки) добавлением 35 мкл JB-4 Вложение решение "B" (ООО Polysciences 0226B) для каждого мл инфильтрации решение. Добавить 35 мкл JB-4 Вложение решение "B" (Polysciences Инк 0226B) для каждого мл инфильтрации решение. Тщательно перемешать, пипетирования вверх и вниз с пластиковой пипетки Пастера в несколько раз. Это важно, потому что, если не смешиваются и JB-4 не будет полимеризоваться должным образом. После 5 мл вложение пластик был подготовлен, удалите пластиковую инфильтрации из разных образцов с пипетки Пастера. Заполните чашку с вложением пластика. Пластик должен сочиться из чашки, чтобы обеспечить правильное прикладывание блока держателя образца. Для обнаружения данио почечных канальцев, поперечные срезы лучше. Для этого рыбу встраиваются вертикально, головой вниз. При помощи ресниц с ручкой или тонкого пинцета, периодически положение рыбы вертикально, пока пластик является достаточно сложным делом, что они не двигаются от их позиции. Она занимает около 20-30 минут. Затем поместите EBH-2 Блока Организатор (Polysciences ООО 15899) по сравнению с чашками и оставить лотка при 4 ° С в течение ночи. При полимеризации в полный, можно выскочить блоков, как кубики льда.
• Альтернативный протокол вложение нескольких личинок: Заполните форму на полпути с полной JB-4 и позволяет ему полимеризоваться. Для 15 мм квадратной формы мы используем JB-4 объемом в 700μl заполнить форму на полпути. Затем добавьте JB-4 пропитанной личинок с отвердителем, чтобы предварительно полимеризованного наполовину заполненной формы. Восток личинки с головой указывая на длинной стороне формы и выравнивания личинки так до глазных яблок строки (можно поставить 10 рыб в одной единственной формы, в линию). После блока полимеризуется вы можете вырезать блок краев, поверните его так, лицевой стороной ножа и суперклей его пластика "патрон", который вписывается в микротоме. С помощью этого метода можно расположить большое количество личинок в одном блоке с центром в пластик, и готовы к сечений. Уход должен быть принят ориентировочно блок нож так, что эквивалентные участки каждой рыбы взяты в одном разделе. Это может быть достигнуто при секционирования глазами: то есть ориентироваться блок так, что эквивалентные участки глаза взяты для каждой рыбы. Конечным результатом является то, что вы можете анализировать многие рыбы одновременно на одном слайде микроскопа.

Часть 4: Секционирование

• Установить образец в держатель патрон микротома (мы используем Shandon Finesse Thermo Electro корпорации микротома)
• Установите слайд теплее 45 ° C.
• Налейте воду в DI стакан и положите его рядом с микротома
• Перед секционирования, убедитесь, что блок ориентирован таким образом, чтобы получить идеальный поперечном сечении рыбы. Ориентация рычаги голову регулировки могут быть повернуты позволяет позиционировать образец головой точно ножом. Начало резки толстых секций через голову рыбы. Хотя срезов через глаза, ориентироваться блок так, что эквивалентные участки глаза взяты для каждой рыбы. Когда грудные плавники появляются в разделах, то есть когда pronephric канальцев начала. С этого момента сократить около 32 4 мкм разделы из блока.
• Сбор разделы щипцами, и пусть они падают в стакан с водой, не касаясь воды с щипцами. Раздел будет расширяться, как только она попадает на поверхность воды, то теперь вы можете получить его на слайде. Вставьте слайд в воду под углом 45 ° и подход раздел с помощью ресниц с ручкой, касаясь только границы раздела.
• Инкубируйте слайды на слайде теплее до полного высыхания.
• Изображение разделы, используя epifluorescent или конфокальной микроскопии.

Часть 5: представитель ResULTS

При правильном выполнении вводили рыбу выглядеть, как на рисунке 1, с небольшим флуоресцентные декстрана (в данном случае Люцифер желтый) видны в сердце и в кровеносной системе. Если инъекция слишком глубоко, вводят материал можно увидеть сосредоточены в желточный мешок, или сердца может быть проколот вызывая кровотечение. Если пипетка холдинг сделано правильно, рыбы не будут выброшены или двигаться, когда вводили, и это позволит более точно инъекции. Кроме того, важно, чтобы убедиться, не иметь никаких пузырьков воздуха в ММП, которое может привести к замедлению времени реакции и снижение точности системы. Вообще, как следствие нефротоксичности гентамицина, 80% вводили рыбу развиваться отек перикарда (рис. 2). Мы используем фенотип система классификации, в которых рыба с умеренным отеком показывают, очевидно перикардиальный отек, но никакие другие наблюдаемые фенотипы, в то время сильно отечной рыбы показать перикарда и магистральных отек, с легкой до умеренной оси кривизны. Использование почечных канальцах антител против Na ⁺ / K ⁺ АТФазы (α-6F), мы можем визуализировать повреждения канальцев в поперечном сечении, с очевидной потерей полярности клеток и трубчатых нарушения в поврежденные канальцы, по сравнению с контрольной группой (рис. 3). Такая же ситуация наблюдается через несколько поперечных срезов. Для того чтобы получить идеальный поперечных участков почечных канальцев важно положение рыбы правильно во вложении. При сравнении разделов, грудные плавники и проксимальных извитых канальцев используются в качестве анатомических маркеров.

Рисунок 1. Nephrotoxin микроинъекции. () Успешное введение 10kDa декстран конъюгированных с Люцифером желтые, со слабым выражение в общих кардинальных вен, белая стрелка. (Б) Неправильно инъекции, в результате сдачи на хранение 10kDa декстран конъюгированных с Люцифером желтый, которая не рассеивается в кровеносную систему, красной стрелкой.

Рисунок 2. Гентамицин-опосредованной отек. () Контроль вводится личиночной рыбок данио. Гентамицин вводят личиночной данио с (В) или умеренная (C) тяжелые отеки. Все личинки в 4 денье с впереди левой и спинной вверх. Черные стрелки указывают на перикардиальный отек в В и С.

Рисунок 3. AKI иммуногистохимии. α-6F антител окрашивание на Na ⁺ / K ⁺ АТФазы 48 часов с должностями гентамицин инъекции (4 денье личинки) в контроле (А, В) и гентамицин вводят внутривенно (C, D) личинок. , C находятся на 20-кратным увеличением и В и D являются 3-кратным цифровым увеличением в правый канальцы и C. Обратите внимание, потеря базолатеральной полярности и трубочку нарушения, белая стрелка, в D по сравнению с B.

Discussion

В этом видео статье мы продемонстрировали, внутривенное техники микроинъекции для модели АКИ, создавая гентамицин опосредованной проксимальных канальцев ущерб в данио личинок. Это повреждение приводит к образованию перикарда и / или грубой отек, отражающие неспособность регулировать водный баланс. Мы также описаны иммуногистохимии экспериментировать с антителом, которое марок дифференцированные канальцев почек (Маджумдар и соавт. 2000), показывая, потеря клеточной полярности и нарушение проксимальных канальцах в поврежденных почек. Внутривенно микроинъекций представляют собой эффективный метод доставки растворимые вещества в кровоток данио личинок. Эта техника является превосходным инструментом для введения различных веществ и с помощью флуоресцентных инъекции единый маркер может повторяться много раз позволяет устойчивые результаты.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope