Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

Summary

Se describe una técnica de microinyección de los aminoglucósidos, la gentamicina, en 2 días después de la fetilization (DPF) de larvas de pez cebra para inducir insuficiencia renal aguda (IRA). También describe un método para montar toda la inmunohistoquímica, plástico inclusión y corte de las larvas de pez cebra para visualizar el daño mediado por IRA.

Abstract

En este artículo se describe un vídeo modelo del pez cebra de AKI usando gentamicina como la nephrotoxicant. La técnica consiste en microinyecciones intravenosa en el pez cebra fdd 2. Esta técnica representa un método eficaz y rápido de entrega de sustancias solubles en el torrente sanguíneo de las larvas de pez cebra, lo que permite la inyección de pescado 15-20 por hora. Además de los estudios AKI, esta técnica de microinyección también se puede utilizar para otros tipos de estudios experimentales, como la angiografía. Ofrecemos un protocolo detallado de la técnica de los equipos necesarios para las medidas visuales de la función renal disminuida. Además, también demuestran el proceso de fijación, inmunohistoquímica montar todo con un marcador de los túbulos renales, la incorporación de plástico y corte de las larvas de pez cebra. Demostramos que larvas de pez cebra inyectados con gentamicina muestran características morfológicas compatibles con lesión renal aguda: edema, pérdida de polaridad celular en las células epiteliales tubulares proximales, y la alteración morfológica de los túbulos.

Protocol

Parte del protocolo siguiente se basa en los métodos publicados reportados por (Hentschel et al. 2005) y (Weinstein et al. 1995) con ligeras modificaciones.

Parte 1: microinyecciones

Establecido de antemano para la microinyección

• Los peces se inyectan a los 2 días después de la fertilización (dpf). Por lo tanto, el pez cebra adultos se crían tres noches antes de un experimento planeado. Recoger los embriones y colocarlos en una placa de Petri con agua E3 (5 mM NaCl, 0,17 mm KCL, 0,33 mm _de CaCl2, 0,33 mm _MgSO4) a 28,5 ° C. Al final de la primera jornada eliminar embriones muertos a partir de la placa de Petri y los embriones separado, de modo que hay 80 a 100 embriones por placa de Petri.
• Prepare las agujas de vidrio tirando de los tubos capilares (4 pulgadas de largo, 0,63 / 0,20 OD / ID milímetros (mm) R-6 tubos de vidrio personalizada Drummond científicos de la empresa, Broomall, PA 9-000-3000) con un extractor de electrodos. El diámetro de la punta debe ser de 10 a 20 micras. En un microscopio (Leica S6E), con un marcador permanente dibujar aproximadamente 10 líneas de 1 mm a lo largo de la aguja, con la ayuda de una regla, y guardar las agujas en un gran plato de Petri en las rampas de arcilla.
• Prepare la pipeta de sujeción: Fuego-pulir la punta de un tubo delgado con paredes de vidrio de borosilicato capilares (152 mm, 1 / 0.75 OD / ID mm TW100-6, Instrumentos del Mundo de precisión, Inc.) en una llama de mechero Bunsen hasta que el diámetro interior de la punta es de 0,4-0,5 mm. Tal dimensión permite un buen agarre del saco vitelino de las larvas de pez cebra fdd 2. Sostenga un extremo de un trozo de vidrio capilar mediante unas pinzas largas, y el calor extremo opuesto, con el capilar con el mechero Bunsen, colocándolo en la vertical del cono de luz azul interior de la llama, la parte más caliente, durante 1-2 segundos, rodar para obtener una incluso fundirse. Repita esta operación varias veces a continuación, examinar los capilares bajo el microscopio, en un micrómetro (94 W Ward 9910). Este es un paso crítico, podría ser necesario para disparar a pulir una celebración de unos pocos pipetas y seleccionar el tamaño adecuado después, mientras está manipulando las larvas. Si usted tiene cuidado, la celebración de una pipeta de microinyección tiene una duración de sesiones múltiples.
• Llene la bomba Microjeringa Manual (MMP, World Precision Instruments, Inc.), con aceite mineral, siguiendo las instrucciones dadas por el fabricante. El titular de la pipeta se inserta en un manipulador joystick (Narishige, MN-151), conectado con un soporte magnético (Narishige, MN 151) a una placa de hierro (Narishige, IP).

Microinyección

• Prepare 20μl de la mezcla de inyección:. 2.4μl gentamicina (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml en solución salina) y 10-kDa 17.6μl amarillo lucifer dextrano (Invitrogen D1825, (1mg/ml en solución salina) en los peces de control de la gentamicina se reemplaza con una solución salina. El dextrano fluorescente (diferentes colores se pueden utilizar) es suficiente para verificar la exactitud de la inyección y seleccionar las larvas que han sido inyectados con la nephrotoxicant.
• Prepare dos cajas de Petri de 30 mm con 2 ml de aceite mineral para la colocación de la mezcla de inyección y control de la mezcla bajo, para evitar la evaporación de las soluciones.
• Prepare la anestesia: 400 mg polvo tricaína (etil-m-aminobenzoato metanosulfonato SIGMA A-5040) 97,7 ml de agua DD, 2,1 ml Tris 1M (pH 9). Ajustar a pH 7. Guarde esta solución de reserva en el congelador, en alícuotas de 4,2 ml. Para utilizar tricaína como anestésico diluir los 4,2 ml de solución de tricaína en 100 ml de agua E3 (Westerfield 1993) y dejar a temperatura ambiente.

Los siguientes pasos se realizan bajo un microscopio de disección

• Elimine manualmente los coriones restantes con unas pinzas finas y anestesiar al pez cebra transferir en una placa de Petri con tricaína calentado a temperatura ambiente. Pez cebra se debe exponer a tricaína al menos 15 minutos antes de iniciar el microinyecciones.
• Abra la punta de la aguja de la inyección con una cuchilla de afeitar (VWR 55411-050 científica). Mantenga la hoja con un ligero ángulo para crear un bisel y cortar la punta, como para obtener una abertura de aproximadamente un diámetro de 10-20μm.
• A su vez en el poder, el vacío y el suministro de aire del aparato de microinyección (World Precision Instruments Inc., PV820 neumáticos picopump). Insertar la aguja en el porta-agujas montadas sobre la base de micromanipulador y la inclinación (la Palabra de Instrumentos de Precisión, Inc., modelo M3301R, TB-1).
• Para llenar la aguja, coloque una gota (10μl) de la solución que se inyecta en la placa de Petri de 30 mm con aceite mineral (productos químicos Fisher, 0121-1). A su vez el micromanipulador manual de modo que quede sumergida la punta de la aguja en la gota de la solución, establecer el picopump "mantener / ventilación" cambiar a "vent" ("vent" equivale al vacío en el PV820), y llenar la aguja tirando solución a través de la punta de la aguja. Esto tomará unos pocos minutos, si la solución se introduce la aguja demasiado rápido,que significa que el diámetro de la punta es demasiado grande, y las inyecciones no será exacta. Después de que la aguja está lleno, el conjunto picopump a "mantener" ("hold" equivale a inyectar en el PV820).
• Para calibrar la aguja, ajuste el picopump "cerrado / tiempo" cambiar a "cerradas", presione el pedal de descarga de la aguja, y registrar el tiempo que tarda (en segundos) para el menisco para viajar de una marca a otra (1 distancia total mm). Repita 3 veces, se toman el tiempo promedio (en segundos), y dividir el valor por 30 (volumen en nanolitros (NL), correspondiente a la distancia de 1 mm lineal) para determinar el número de milisegundos necesarios para ofrecer una solución de nl. Ajuste el mando período rango a este número, y mover el "cerrado / tiempo" cambiar a "tiempo". Ahora el picopump es ajustarlo para que el pulso 1NL de solución.
• Retirar la cápsula de aceite mineral y la posición de la placa de Petri con las larvas bajo el microscopio. Grupo de los peces en el centro de la placa de Petri y el enfoque.
• Coloque la pipeta de sujeción de la bomba manual de microjeringa (MMP, instrumentos de precisión del mundo) en el lado opuesto de la microinyector, el avance de la punta de la placa de Petri, y en el plano de enfoque del microscopio. Curva con un ángulo bastante superficial, por lo que la punta de la pipeta de sujeción está en contacto con la parte inferior de la placa de Petri y se encuentra cerca de la horizontal. Asegúrese de no tener ninguna burbuja de aire en el sistema, lo que retrasaría el tiempo de respuesta y disminuir la precisión de la MMP.
• Cambiar a un mayor aumento en el microscopio y el uso de una pestaña superfino con mango (Ted Pella 113) a la posición de la parte dorsal de larvas de peces hacia abajo con la yema muy cerca de la pipeta de sujeción. Sostenga el de larvas de peces por la succión de la yema en la pipeta de sujeción girando hacia la izquierda de la unidad de control micrométrico de la bomba microjeringa manual. Tenga cuidado de no girar el micrométrico demasiado lejos, como la yema de huevo puede explotar si se tira demasiado profundamente en la pipeta de sujeción. Se centran en la formación de la vena cardinal común, que se encuentra en la yema de huevo, justo debajo de la peridermis y es el sitio del flujo de sangre muy alto. Con el micromanipulador de los aparatos de inyección, guía la aguja en la vena cardinal común de desarrollo. Que suele ser necesario para tirar de la aguja hacia atrás un poco después de la inserción, como la vena cardinal común es muy superficial. Inyectar 1NL de solución presionando el pedal de pie, a continuación, suelte las larvas de la pipeta de sujeción y devolverlo al agua embrión. Este es un paso crítico, especialmente la primera vez, ya que requiere una cierta práctica en el posicionamiento de los peces y el control de la succión y la presión de la plataforma. Si la yema del embrión está bien mantenido con la pipeta de sujeción, que no ruede cuando la aguja entra.
• Para verificar el éxito de la microinyección, controlar la presencia de dextrano amarillo lucifer en el corazón del pez cebra con un microscopio fluorescente. El amarillo lucifer permanece visible en el corazón durante aproximadamente 20 minutos antes de disiparse en el sistema circulatorio Si la solución se inyecta correctamente nefrotóxicos, dentro de 2 horas de la inyección que se ve muy poco amarillo lucifer dextrano restante en el lugar de la inyección. Si la solución se inyecta en el saco vitelino, una mancha de amarillo lucifer dextrano se mantendrá en el sitio de la inyección. (Fig. 1). Volver a los peces a medio E3.
• Dos días después de la inyección, las larvas se desarrollan edema pericárdico, como consecuencia de la función renal disminuida (Fig. 2).

Parte 2: La fijación y la inmunofluorescencia con Na ⁺ / K ⁺ ATPasa de anticuerpos (α-6F)

• A las 4 dpf, poner entre 10 y 15 larvas de pez cebra en viales de vidrio de 4 ml (Weathon, 225,012) y fijarlos en la Dent 1 ml (80% MeOH 20% DMSO) durante 4 horas a temperatura ambiente.
• Rehidratar a los embriones en una graduada MeOH / PBT (PBS con 0,5% de Tween 20) series, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, la solución de pipeta y la adición de la nueva solución para el mismo vial (1 ml de solución por vial), a 20 minutos en cada solución. Las larvas no deben ser expuestos al aire, dejar un poco de solución que cubre las larvas al cambiar de soluciones.
• Quitar PBT y reemplazar con 1 ml solución de bloqueo (PBS con 1% de DMSO, 0,5% de Tween 20, 10% de suero normal de cabra) durante 3 horas a 4 ° C en un nutator.
• Transferencia de las larvas en una microcentrífuga de 2 ml. Quitar el bloqueo de suero y reemplazar con el anticuerpo primario en 300μl solución de incubación (PBS con 1% de DMSO, 0,5% de Tween 20, 2% suero normal de cabra) durante la noche a 4 ° C en un nutator. Utilizamos un anticuerpo monoclonal Na ⁺ / K ⁺ ATPasa de anticuerpos (α-6F, Estudios sobrenadante, Desarrollo del Banco hibridoma, Iowa) en la dilución 1:25
• Eliminar el anticuerpo primario y lavar 3 x 30 minutos con solución de incubación a temperatura ambiente.
• Se incuba con el anticuerpo secundario (de cabra anti-ratón Cy3, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 155-165-003) diluido 1:500 en solución de incubación durante 2 horas aRT.
• Lavar 3 x 30 minutos con PBT.

Parte 3: La inclusión de plástico con JB-4

• Deshidratar los tejidos a través de una serie de etanol clasificado (50%, 75%, 95%, 100% x 2), a 10 minutos por paso.
• Prepare la solución de infiltración: 25 ml de solución de JB-4 incrustación A (Polysciences 0226A) y 0,24 g de catalizador (Polysciences 02.618). Se toma un tiempo para que el catalizador se disuelven, alrededor de 20-30 minutos. La solución se puede almacenar a 4 ° C hasta 1 mes.
• Decantar el etanol 100% y reemplazarlo con solución de infiltración de plástico. Colocar los viales a 4 ° C en un rotor y permitir la infiltración a cabo hasta el fregadero de larvas en el fondo de la ampolla de vidrio. Este proceso suele tardar unos 30 minutos.
• Incorporación de protocolo: Coloque la bandeja de moldeo vaso de plástico (Polysciences, Inc. 16643A) bajo un microscopio de disección. Transferencia de las larvas, así como solución de infiltración para cubrir, en las tazas. Los medios de inclusión de plástico se introduce en una botella de plástico. Por lo general incrustar 4-5 peces a la vez, un pez por cada taza. Preparar 5-6 ml de inclusión plástica (1,2 ml de solución de incrustar en cada taza) añadiendo 35 l de JB-4 Incorporación de solución "B" (Polysciences Inc. 0226B) por cada ml de solución de infiltración. Añadir 35 l de JB-4 Solución Embedding "B" (Polysciences Inc. 0226B) por cada ml de solución de infiltración. Mezclar bien, pipeteando arriba y abajo con una pipeta Pasteur de plástico veces varios. Esto es importante porque si no se mezcla bien la JB-4 no se polimeriza correctamente. Después de 5 ml de inclusión plástica ha sido preparada, retire la infiltración de plástico de todo muestras con una pipeta Pasteur. Llene la taza con la incrustación de plástico. El plástico debe salir fuera de la taza, para asegurar un buen agarre del titular de la bloque de la muestra. Para detectar el pez cebra túbulos renales, las secciones transversales son los mejores. Para ello, los peces están integrados verticalmente, cabeza abajo. Con la ayuda de una pestaña con mango o unas pinzas finas, de forma periódica la posición de los peces en vertical, hasta que el plástico es bastante difícil que no se mueven de su posición. Se tarda unos 20-30 minutos. Luego, coloque el titular de la EBH-2 Block (Polysciences Inc. 15899) a través de las copas y dejar la bandeja a 4 ° C durante la noche. Cuando la polimerización en total, que puede hacer estallar los bloques como cubitos de hielo.
• Protocolo de incorporación de alternativas para las larvas de varios: Llene los moldes hasta la mitad con completa JB-4 y deje que se polimeriza. Para los 15 mm moldes cuadrados se utiliza el volumen de JB-4 en 700μl para llenar el molde hasta la mitad. A continuación, agregue las larvas JB-4 empapado con el endurecedor a la pre-polimerizado a medio llenar moldes. Orientar a las larvas con la cabeza apuntando hacia el lado largo del molde y alinear las larvas por lo que el hasta la línea de ojos (puedes poner 10 peces en un solo molde, en una línea). Después de que el bloque se polimeriza usted puede cortar los bordes de bloques, a su vez que para que el lado que se enfrenta el cuchillo y pegamento a un plástico "Chuck" que cabe en el microtomo. Con este método se puede colocar un gran número de larvas en el mismo bloque, centrado en el plástico, y listo para las secciones transversales. Cuidado hay que tener la orientación del bloque para el cuchillo para que las secciones equivalentes de cada pez se toman en una sola sección. Esto se puede lograr, mientras que el corte a través de los ojos: es decir, orientar el bloque para que las partes equivalentes de los ojos se toman para cada pez. El resultado final es que se pueden analizar muchos peces mismo tiempo, en un portaobjetos de microscopio simple.

Parte 4: El corte

• Establecer la muestra en el soporte de sujeción del microtomo (se utiliza una finura de Thermo Shandon Electro Corporación microtomo)
• Establecer la diapositiva más caliente a 45 ° C.
• Vierta el agua DI en un vaso y lo coloque cerca de la microtomo
• Antes de cortar, asegúrese de que el bloque está orientado, como para obtener perfecta secciones transversales de los peces. Las palancas de ajuste de la cabeza de orientación se puede girar permitiendo a la posición de la cabeza muestra con precisión que el cuchillo. Empezar a cortar secciones gruesas a través de la cabeza del pez. Mientras que el corte a través de los ojos, orientar el bloque para que las secciones equivalentes de los ojos se toman para cada pez. Cuando las aletas pectorales aparecen en las secciones, es decir, cuando los túbulos pronephric principio. Desde este punto, cortar cerca de 32 secciones de 4 um del bloque.
• Recoger las secciones con las pinzas y las dejó caer en el vaso con agua, sin tocar el agua con las pinzas. La sección se ampliará tan pronto como se llega a la superficie del agua, ahora se puede recoger en una diapositiva. Insertar la diapositiva en el agua en un ángulo de 45 ° y el enfoque de la sección con la ayuda de una pestaña con mango, tocando sólo las fronteras de la sección.
• Incubación los portaobjetos en una diapositiva más caliente hasta que esté completamente seco.
• Secciones de imagen por microscopía confocal o epifluorescencia.

Parte 5: Res RepresentanteULTS

Cuando se realiza correctamente, los peces inyectados aparecerán como en la figura 1, con poco dextrano fluorescentes (en este caso amarillo lucifer) visible en el corazón y en el sistema circulatorio. Si la inyección es demasiado profunda, la sustancia inyectada puede ser visto concentrada en el saco vitelino, o el corazón puede ser perforado causar sangrado excesivo. Si la pipeta de sujeción se realiza correctamente, los peces no se mueva o se mueven cuando se inyecta, y esto permitirá una administración más precisa. Además, es importante asegurarse de no tener burbujas de aire en el MMP, lo que retrasaría el tiempo de respuesta y disminuir la precisión del sistema. Por lo general, como consecuencia de la nefrotoxicidad gentamicina, el 80% de los peces inyectados desarrollar edema pericárdico (Fig. 2). Usamos un sistema de clasificación basado en el fenotipo, en el que los peces con edema moderado muestran edema pericárdico evidente, pero no a otros fenotipos observables, mientras que los peces severamente edematoso muestran edema pericárdico y el tronco, con leve a moderada curvatura del eje. Utilizando un anticuerpo contra el túbulo renal de Na ⁺ / K ⁺ ATPasa (α-6F) podemos visualizar los túbulos dañados en las secciones transversales, con una evidente pérdida de polaridad celular y la alteración tubular en los túbulos dañados en comparación con los controles (Fig. 3). Este patrón es consistente a través de múltiples secciones transversales. Con el fin de obtener perfecto secciones transversales de los túbulos renales es importante la posición de los peces correctamente durante la inmersión. Al comparar las secciones, las aletas pectorales y túbulo contorneado proximal se utilizan como marcadores anatómicos.

Figura 1. Microinyección nefrotoxina. (A) de la inyección con éxito de un dextrano 10kDa conjugados con amarillo lucifer, con expresión débil en la vena cardinal común, flecha blanca. (B) de la inyección incorrecta, lo que resulta en un depósito de 10kDa dextrano conjugado con amarillo lucifer que no se disipa en el sistema circulatorio, la flecha roja.

Figura 2. Gentamicina mediada por edema. (A) Control inyecta larvas de pez cebra. Gentamicina inyectada con larvas de pez cebra (B) o moderada (C) edema severo. Todas las larvas se encuentran en 4 dpf con anterior a la izquierda y dorsal está arriba. Flechas de color negro a punto de edema pericárdico en B y C.

Figura 3. AKI inmunohistoquímica. α-6F anticuerpos tinción de Na ⁺ / K ⁺ ATPasa de 48 horas post-inyección de gentamicina (4 larvas DPF) en el control (A, B) y se inyecta gentamicina (C, D) las larvas. A, C están a 20X y de B y D son 3X ampliaciones digitales de los túbulos derecho en la pérdida de una nota y C. de la polaridad y la interrupción basolateral del túbulo, la flecha blanca, en el D, en comparación con B.

Discussion

En este artículo de vídeo que demuestra una técnica de microinyección intravenosa de un modelo de lesión renal aguda, mediante la creación de gentamicina daño mediado por el túbulo proximal de las larvas de pez cebra. Este daño resulta en la formación del pericardio y / o edema bruto, lo que refleja una incapacidad de regular el equilibrio hídrico. También se describe un experimento inmunohistoquímica con un anticuerpo que marca los túbulos renales diferenciadas (Majumdar et al. 2000), muestra la pérdida de la polaridad celular y una alteración del túbulo proximal en los riñones dañados. Microinyecciones intravenosas representan un método eficaz para la entrega de una sustancia soluble en el torrente sanguíneo de las larvas de pez cebra. Esta técnica es una herramienta excelente para la introducción de una variedad de sustancias y con la ayuda de una inyección uniforme fluorescente marcador se puede repetir muchas veces lo que permite obtener resultados consistentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope