Microinjections intraveineuse de larves de poisson zèbre pour étudier lésions rénales aiguës

Summary

Nous décrivons une technique de micro-injection de la famille des aminosides, la gentamicine, en 2 jours post-fetilization (DPF) des larves de poisson zèbre pour induire des lésions rénales aiguës (IRA). Nous décrivons également une méthode pour monter toute l'immunohistochimie, plastique enrobage et de sectionnement des larves de poisson zèbre pour visualiser les dégâts médiation AKI.

Abstract

Dans cet article, vidéo, nous décrivons un modèle de poisson zèbre en utilisant des AKI que la gentamicine nephrotoxicant. La technique consiste à microinjections intraveineuse sur 2 zebrafish DPF. Cette technique représente une méthode efficace et rapide pour livrer des substances solubles dans le sang des larves de poisson zèbre, permettant l'injection de poissons 15-20 par heure. En plus des études AKI, cette technique de micro-injection peut également être utilisé pour d'autres types d'études expérimentales telles que l'angiographie. Nous fournissons un protocole détaillé de la technique de l'équipement nécessaire pour des mesures visuelles de la fonction rénale diminuée. En outre, nous avons également démontrer le processus de fixation, immunohistochimie monter l'ensemble avec un marqueur tubules rénaux, enrobage de plastique et de sectionner le poisson zèbre larvaire. Nous démontrons que les larves de poisson zèbre injecté avec la gentamicine montrent des caractéristiques morphologiques compatibles avec AKI: œdème, perte de polarité cellulaire dans les cellules épithéliales des tubules proximaux, et les perturbations morphologiques du tubule.

Protocol

Partie de ce protocole suivant est basé sur des méthodes publiées rapporté par (Hentschel et al. 2005) et (Weinstein et al. 1995) avec de légères modifications.

Partie 1: microinjections

Mettre en place à l'avance pour la microinjection

• Les poissons sont injectés à deux jours après la fécondation (DPF). Par conséquent, le poisson-zèbre adulte sont élevés 3 nuits avant une expérience envisagée. Recueillir les embryons et les placer dans une boîte de Pétri avec de l'eau E3 (5mm de NaCl, KCl 0.17mm, 0.33mm CaCl _2, MgSO ₄ 0.33mm) à 28,5 ° C. A la fin de la première journée retirer les embryons morts de la boîte de Pétri et les embryons séparés de sorte qu'il ya 80 à 100 embryons par boîte de Pétri.
• Préparer les aiguilles de verre en tirant des tubes capillaires (4 pouces de longueur, 0,63 / 0,20 OD / ID millimètre (mm) R-6 tubes de verre personnalisé Drummond scientifiques société, Broomall, PA 9-000-3000) avec un extracteur d'électrode. Le diamètre de la pointe doit être de 10-20 um. Sous un microscope à dissection (Leica S6E), avec un marqueur permanent tirage d'environ 10 lignes 1mm long de l'aiguille, avec l'aide d'une règle, et de stocker les aiguilles dans un grand plat de Pétri sur les rampes d'argile.
• Préparer la pipette de maintien: Feu-polonais de la pointe d'un mince tube de verre borosilicate paroi capillaire (152 mm, 1 / 0,75 OD / ID mm TW100-6, Instruments de précision World, Inc) dans une flamme du bec Bunsen jusqu'à ce que le diamètre intérieur de la pointe est 0,4-0,5 mm. Ces dimensions permet une bonne prise du sac vitellin d'une larve 2 dpf poisson zèbre. Tenir une extrémité d'un morceau de verre capillaire en utilisant une pince longue, et la chaleur de la pointe opposée avec du capillaire avec le bec Bunsen, en le plaçant verticalement sur le cône de lumière intérieure bleue de la flamme, la partie la plus chaude, pendant 1-2 secondes, rouler pour obtenir une même fondre. Répétez cette opération plusieurs fois puis examiner les capillaires sous le microscope, sur un micromètre (Ward 94 W 9910). Ceci est une étape critique, il pourrait être nécessaire pour polir un feu pipettes détenant peu et choisir la taille appropriée tard, alors que vous manipulez les larves. Si vous êtes prudent, l'un tenant la pipette dure pour les sessions de la micro-injection multiples.
• Remplir la pompe manuelle Microseringue (MMP, World Precision Instruments, Inc,) avec de l'huile minérale, en suivant les instructions données par le fabricant. Le porte-pipette est insérée dans un manipulateur joystick (Narishige, MN-151), relié à un support magnétique (Narishige, MN 151) à une plaque de fer (Narishige, IP).

Microinjection

• Préparer 20 pi du mélange d'injection:. 2.4μl gentamicine (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml dans une solution saline) et 17.6μl 10 kDa Lucifer Yellow dextrane (Invitrogen D1825, (1mg/ml dans une solution saline) dans les poissons de contrôler la gentamicine est remplacé par une solution saline. Le dextran fluorescent (de couleurs différentes peuvent être utilisées) est suffisant pour vérifier l'exactitude de l'injection et de sélectionner les larves qui ont été injectés avec les nephrotoxicant.
• Préparer deux boîtes de Pétri de 30mm avec une huile minérale 2ml pour placer le mélange d'injection et du mélange de contrôle en vertu, pour empêcher l'évaporation des solutions.
• Préparer l'anesthésie: 400 mg de poudre tricaïne (éthyl-m-aminobenzoate méthanesulfonate Sigma A-5040) 97,7 ml d'eau JJ, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Ajuster le pH à 7. Conserver cette solution stock dans le congélateur, en aliquots de 4,2 ml. Pour utiliser tricaïne comme anesthésique diluer la solution stock de 4,2 ml d'eau dans 100 tricaïne E3 ml (Westerfield 1993) et laisser à température ambiante.

Les étapes suivantes sont effectuées sous un microscope à dissection

• Supprimer manuellement toute chorions restantes avec une pince fine et anesthésier le poisson zèbre en les transférant dans une boîte de Pétri avec tricaïne réchauffé à la température ambiante. Zebrafish devraient être exposés à tricaïne au moins 15 minutes avant le début du microinjections.
• Ouvrez la pointe de l'aiguille d'injection en utilisant une lame de rasoir (VWR Scientific 55411-050). Tenez la lame avec un léger angle afin de créer un biseau et couper l'extrémité de manière à obtenir une ouverture pourboire d'environ 20μm de diamètre 10.
• Tournez sur la puissance, de vide et d'air de l'appareil de micro-injection (World Inc instruments de précision, pneumatiques PV820 picopump). Insérez l'aiguille dans le porte-aiguille monté sur la base micromanipulateur et inclinable (instruments de précision Parole, Inc Modèle M3301R, TB-1).
• Pour combler l'aiguille, placer une goutte (10 ul) de la solution à injecter dans le plat de Pétri 30mm rempli d'huile minérale (substances chimiques Fisher, 0121-1). Tournez le micromanipulateur manuel afin d'immerger la pointe de l'aiguille dans la goutte de solution, régler le picopump "hold / évent« commutateur de «se défouler» («vent» équivaut à vide sur la PV820), et de remplir l'aiguille en tirant solution à travers l'aiguille. Cela va prendre quelques minutes, si la solution pénètre dans l'aiguille trop vite,ce qui signifie que le diamètre de l'embout est trop gros, et les injections ne seront pas exactes. Une fois l'aiguille est remplie, réglez le picopump à "conserver" ("hold" équivaut à injecter sur le PV820).
• Pour calibrer l'aiguille, régler la picopump "gated / chronométré" passer à "gated", appuyez sur la pédale de s'acquitter de l'aiguille, et d'enregistrer le temps qu'il faut (en secondes) pour le ménisque à voyager d'un marquage à l'autre (1 mm distance totale). Répétez 3 fois, prenez le temps moyen (en secondes), et de diviser la valeur par 30 (volume en nanolitres (nl) correspondant à 1 mm de distance linéaire) pour déterminer le nombre de millisecondes nécessaires pour offrir une nl de solution. Réglez le bouton période de gamme pour ce numéro, et déplacer les "gated / chronométré" passer à "chronométré". Maintenant, le picopump se prépare à livrer une impulsion 1NL de solution.
• Retirer le plat d'huile minérale et de la position la boîte de Pétri avec les larves sous le microscope. Groupe des poissons dans le centre de la boîte de Pétri et de se concentrer.
• Placez la pipette de maintien de la pompe manuelle microseringue (MMP, les instruments de précision du monde) sur le côté opposé de la microinjecteur, avance sa pointe à la boîte de Petri, et dans le plan focal du microscope. Bend it avec un angle assez peu profonds, de sorte que la pointe de la pipette de maintien est de toucher le fond de la boîte de Pétri et est proche de l'horizontale. Assurez-vous que ne pas avoir de bulle d'air dans le système, ce qui permettrait de ralentir le temps de réponse et de diminuer la précision de la MMP.
• Changement à un grossissement plus élevé sur le microscope et utiliser un cil superfine avec poignée (Ted Pella 113) à la position du côté de larves de poisson dorsale vers le bas avec le jaune très proche de la pipette de maintien. Tenez le larves de poisson en suçant le jaune dans la pipette de maintien en tournant le disque micrométrique antihoraire commande de la pompe manuelle microseringue. Prenez soin de ne pas tourner le micromètre trop loin, comme le jaune peut éclater si tiré trop profondément dans la pipette de maintien. Focus sur la veine cardinale commune formant, qui se trouve sur le jaune d'oeuf, juste sous le périderme et est le site de la circulation sanguine très élevée. Avec le micromanipulateur de l'appareil d'injection, guider l'aiguille dans la veine cardinale commune de développement. Il est généralement nécessaire de retirer l'aiguille un peu en arrière après l'insertion, comme la veine cardinale commune est très superficielle. Injecter 1NL de la solution en appuyant sur la pédale, puis relâchez les larves de la pipette de maintien et de le retourner à l'eau embryon. Ceci est une étape critique, surtout la première fois, car il requiert une certaine quantité de pratique dans le positionnement du poisson et de commander l'aspiration et la pression du gréement. Si le jaune de l'embryon est correctement tenue avec la pipette d'attente, il ne roulera pas que l'aiguille pénètre.
• Pour vérifier le succès de la micro-injection, de surveiller la présence de la dextrane lucifer jaune dans le coeur du poisson-zèbre sous un microscope à fluorescence. Le jaune lucifer reste visible dans le coeur pendant environ 20 minutes avant de se dissiper dans le système circulatoire Si la solution est injectée néphrotoxiques correctement, dans les 2 heures de l'injection, vous verrez très peu de jaune lucifer dextrane restant au site d'injection. Si la solution est injectée dans le sac vitellin, un spot de Lucifer jaunes dextrane restera au site d'injection. (Fig. 1). Retourner le poisson à moyen E3.
• Deux jours après l'injection, les larves se développent un œdème péricardique comme une conséquence de la fonction rénale (Fig. 2).

Partie 2: Fixation et immunofluorescence avec Na ⁺ / K ⁺ ATPase d'anticorps (α-6F)

• A 4 dpf, mettre entre 10 et 15 poisson zèbre larvaire dans des flacons en verre 4ml (Weathon, 225012) et les fixer dans 1ml de Dent (80% de MeOH 20% de DMSO) pendant 4 heures à température ambiante.
• Réhydrater les embryons dans un gradué MeOH / PBT (PBS avec 0,5% de Tween 20) série, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, pipetage la solution hors et en ajoutant nouvelle solution pour le même flacon (1 ml de solution par flacon), à 20 minutes dans chaque solution. Les larves ne doivent jamais être exposés à l'air, laissez une petite solution couvrant les larves lors du changement de solutions.
• Retirer et remplacer PBT 1ml avec une solution de blocage (PBS avec 1% de DMSO, 0,5% Tween 20, 10% de sérum de chèvre normal) pendant 3 heures à 4 ° C sur une nutator.
• Transfert des larves dans une microcentrifugeuse de 2ml. Retirez le blocage de sérum et remplacer avec l'anticorps primaire 300μl de solution d'incubation (PBS avec 1% de DMSO, 0,5% Tween 20, 2% sérum normal de chèvre) nuit à 4 ° C sur un nutator. Nous utilisons un anticorps monoclonal Na ⁺ / K ⁺ ATPase anticorps (α-6F, surnageant, études développementales hybridomes de la Banque, de l'Iowa) à la dilution 1:25
• Retirez l'anticorps primaire et laver 3 x 30 minutes avec une solution d'incubation à température ambiante.
• Incuber avec l'anticorps secondaire (chèvre anti-souris Cy3, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 155-165-003) dilué à 1:500 dans la solution d'incubation pendant 2 heures àRT.
• Laver 3 x 30 minutes avec le PBT.

Partie 3: inclusion plastique avec JB-4

• Déshydrater les tissus à travers une série d'éthanol à (50%, 75% et 95%, 100% x 2), 10 minutes par étape.
• Préparer la solution d'infiltration: 25 ml de JB-4 Solution intégrant un (Polysciences 0226A) et 0,24 g de catalyseur (Polysciences 02618). Il faut du temps pour le catalyseur de se dissoudre, environ 20-30 minutes. La solution peut être conservé à 4 ° C jusqu'à 1 mois.
• Décanter l'éthanol à 100% et la remplacer par solution d'infiltration en plastique. Placer les flacons à 4 ° C sur un agitateur et de permettre l'infiltration de procéder jusqu'à ce que le puits de larves au fond du flacon en verre. Ce processus prend habituellement environ 30 minutes.
• Intégration du protocole: Placez le plateau de moulage en plastique de tasse (Polysciences, Inc 16643A) sous un microscope à dissection. Transfert des larves, avec solution d'infiltration afin de couvrir, dans les tasses. L'intégration des médias en plastique est préparée dans un petit tube en plastique. Nous normalement intégrer 4-5 poisson à la fois, un poisson pour chaque tasse. Préparer 5-6 ml de plastique intégrant (1,2 ml de solution pour intégrer chaque tasse) en ajoutant 35 pl de JB-4 Intégration de solution "B" (Polysciences Inc 0226B) pour chaque ml de solution d'infiltration. Ajouter 35 ul de JB-4 Solution Embedding "B" (Polysciences Inc 0226B) pour chaque ml de solution d'infiltration. Mélangez bien, aspiration et refoulement avec une pipette Pasteur en plastique parfois plusieurs années. Ceci est important car si elle n'est pas bien mélangé le JB-4 ne sera pas polymériser correctement. Après 5ml de plastique intégrant a été préparé, retirez en plastique autour de l'infiltration des échantillons avec une pipette Pasteur. Remplir la tasse avec inclusion plastique. Le plastique doit suinter de la coupe, afin d'assurer une bonne fixation du support de bloc à l'échantillon. Pour détecter le poisson-zèbre tubules rénaux, des sections transversales sont les meilleurs. À cette fin, les poissons sont intégrés verticalement, la tête baissée. Avec l'aide d'un cil avec poignée ou pince fine, périodiquement la position du poisson à la verticale, jusqu'à ce que le plastique est assez dur de ne pas bouger de leur position. Il faut environ 20-30 minutes. Ensuite, placez le titulaire EBH-2 Block (Polysciences Inc 15899) sur les coupes et laissez le tiroir à 4 ° C pendant la nuit. Lorsque la polymérisation est complète, vous pouvez sortir les blocs comme des glaçons.
• Protocole intégrant Alternative pour les larves de plusieurs: Remplir les moules à moitié avec de compléter JB-4 et de lui permettre de polymériser. Pour les 15 moules mm carré nous utilisons le volume JB-4 à 700μl pour remplir le moule à moitié. Ensuite, ajoutez les larves JB-4 imbibé de durcisseur à la pré-polymérisée à moitié rempli des moules. Orienter les larves avec la tête pointant vers le côté le plus long du moule et aligner les larves de sorte que le line up globes oculaires (vous pouvez mettre 10 poissons dans un moule unique en ligne). Après le bloc est polymérisé vous pouvez couper les bords de bloc, il tourne si le côté est confronté le couteau et il colle à une plastique "Chuck" qui s'inscrit dans le microtome. Avec cette méthode, vous pouvez placer un grand nombre de larves dans le même bloc, centré dans le plastique, et prêt pour des sections. Soins doit être prise orientant le bloc pour le couteau de sorte que les articles équivalents de chaque poisson sont prises dans une seule section. Ceci peut être accompli tout sectionnement à travers les yeux: à savoir orienter le bloc de sorte que les articles équivalents des yeux sont prises pour chaque poisson. Le résultat final est que vous pouvez analyser de nombreux poissons de façon concomitante sur une lame de microscope unique.

Partie 4: sectionnement

• Réglez le spécimen dans le porte-mandrin du microtome (nous utilisons un Shandon Finesse Thermo Electro Société microtome)
• Réglez la lame chaude à 45 ° C.
• Versez de l'eau DI dans un bécher et placez-le près de la microtome
• Avant de sectionner, être sûr que le bloc est orientée de manière à obtenir des coupes transversales parfaite du poisson. Les leviers orientation de la tête de réglage peut être tourné permettant de positionner la tête de l'échantillon avec précision au couteau. Commencer à couper les sections épaisses à travers la tête du poisson. Alors que la coupe à travers les yeux, orienter le bloc de manière que les articles équivalents des yeux sont prises pour chaque poisson. Lorsque les nageoires pectorales apparaissent dans les sections, c'est à dire quand les tubules pronephric commencer. De ce point, couper environ 32 um 4 sections du bloc.
• Recueillir les sections avec une pince et de les laisser tomber dans le bécher avec de l'eau, sans toucher l'eau avec la pince. Cette section se développe dès qu'il frappe la surface de l'eau, maintenant vous pouvez le récupérer sur une diapositive. Insérez la lame dans l'eau à un angle de 45 ° et l'approche de la section avec l'aide d'un cil avec poignée, en touchant seulement les frontières de la section.
• Incuber les lames sur une lame chaude jusqu'au séchage complet.
• Sections d'image en utilisant la microscopie à épifluorescence ou confocal.

Partie 5: Res ReprésentantPHP sous

Quand elle est réalisée correctement, le poisson injecté apparaissent comme dans la figure 1, avec peu fluorescentes de dextran (dans ce cas de Lucifer Yellow) visibles dans le cœur et dans le système circulatoire. Si l'injection est trop profonde, matériau injecté peut être vu concentrée dans le sac vitellin, ou le cœur peut être perforé causant un saignement excessif. Si la pipette de maintien est fait correctement, le poisson ne sera pas rouler ou lorsqu'il est injecté, ce qui permettra une injection plus précis. Aussi, il est important de s'assurer de ne pas avoir les bulles d'air dans le PSM, qui permettrait de ralentir le temps de réponse et de diminuer la précision du système. En règle générale, comme une conséquence de la néphrotoxicité de gentamicine, 80% des poissons injectés de développer un œdème péricardique (Fig. 2). Nous utilisons un système de classification basé phénotype, dans laquelle les poissons avec un œdème modéré montrent clairement un œdème péricardique, mais pas d'autres phénotypes observables, alors que les poissons montrent un œdème sévère oedémateux péricardique et le tronc, avec légère à modérée courbure axe. En utilisant un anticorps contre le tubule rénal Na ⁺ / K ⁺ ATPase (α-6F), nous pouvons visualiser les tubules endommagés dans les sections transversales, avec une perte évidente de la polarité cellulaire et la perturbation tubulaires dans les tubules endommagée par rapport aux témoins (Fig. 3). Ce modèle est compatible par le biais de multiples sections transversales. Afin d'obtenir des coupes transversales parfaites des tubules rénaux est important de positionner correctement le poisson lors de l'enrobage. Lorsque l'on compare les sections, nageoires pectorales et tubes contournés proximaux sont utilisés comme marqueurs anatomiques.

Figure 1. Microinjection néphrotoxine. (A) d'injection réussie d'un dextrane 10kDa conjugué à Lucifer jaune, avec une expression faible dans la veine commune cardinaux, flèche blanche. (B) d'injection incorrecte, résultant en un dépôt de 10kDa dextran conjugué au jaune Lucifer qui ne se dissipe pas dans le système circulatoire, la flèche rouge.

Figure 2. Gentamicine médiée par un œdème. (A) Contrôle injecté zebrafish larvaire. Gentamicine injecté zebrafish larvaires avec (B) modérée ou (C) un œdème sévère. Toutes les larves sont à 4 FAP antérieure à la gauche et dorsale est en place. Les flèches noires point à un œdème péricardique en B et C.

Figure 3. AKI immunohistochimie. coloration des anticorps α-6F pour Na ⁺ / K ⁺ ATPase 48 heures après l'injection-gentamicine (4 larves DPF) de contrôle (A, B) et injecté de gentamicine (C, D) des larves. A, C sont à un grossissement de 20x et de B et D sont 3X grossissements numériques des tubules droite dans la perte de la note A et C. de polarité basolatérale et la perturbation des tubules, flèche blanche, en D par rapport à B.

Discussion

Dans cet article, la vidéo, nous avons démontré une technique de microinjection par voie intraveineuse pour un modèle AKI, en créant la gentamicine médiation dommages tubulaires proximales chez les larves de poisson zèbre. Ce dommage résulte en la formation d'péricardique et / ou œdème brute, reflétant une incapacité à réguler l'équilibre hydrique. Nous avons aussi décrit une expérience d'immunohistochimie avec un anticorps qui marque tubules rénaux différenciées (Majumdar et al. 2000), montrant une perte de la polarité cellulaire et une perturbation du tube contourné proximal dans les reins endommagés. Microinjections intraveineuse représentent une méthode efficace pour livrer une substance soluble dans le sang des larves de poisson zèbre. Cette technique est un excellent outil pour l'introduction d'une variété de substances et à l'aide d'une injection fluorescentes uniformes marqueur peut être répété de nombreuses fois au cours permettant des résultats cohérents.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α6F mouse monoclonal	Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2	Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing	Drummond Scientific	9-000-3000
Catalyst Powder	Polysciences, Inc.	02618
Cy3	Jackson ImmunoResearch	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable	Molecular Probes, Life Technologies	D1825
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Eyelash	Ted Pella, Inc.	113
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml	Weathon	225012
Iron plate	Narishige International	IP
JB-4 Embedding Solution A	Polysciences, Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B	Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator	Narishige International	MN 151
Magnetic stand	Narishige International	MN-151
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Shandon Finesse
Mineral oil, light	Fisher Scientific	0121-1
Pipette puller	Kopf Instruments	720
Plastic molding cup tray	Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade	VWR international	55411-050
Slide warmer	Labline Instruments
Stage micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Tilting base	World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder	Sigma-Aldrich	A-5040
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Microscope	Leica Microsystems	S6F	Dissecting microscope
Microscope	Leica Microsystems	M205FA	Fluorescent microscope