定向脑深部结构与配送药品，病毒载体，或细胞移植Microinjections

Summary

在这篇文章中，我们将展示一种方法，使与50微米的管腔玻璃毛细管针。这种技术大大降低大脑的损害，最大限度地减少药物的被动扩散，并允许一个精确的定位到啮齿类动物的大脑。

Abstract

进入脑实质Microinjections很重要的程序，以提供药物，病毒载体或细胞移植。注射针，在其运动轨迹会产生脑部病变是一个主要关注的不仅是大脑小，而且有时需要多次注射，特别是在老鼠大脑。我们在这里展示的方法，以生产50微米管腔，从而显着降低脑损伤，并允许一个精确的定位到啮齿类动物的大脑的玻璃毛细管针。此方法允许小卷交货（从20到100 NL），减少了出血的风险，并最大限度地减少药物进入脑实质的被动扩散。通过使用不同大小的毛细玻璃管，或改变针管腔，几种类型的物质和细胞可以被注入。用玻璃毛细管Microinjections代表在注射技术和针对最小的附带损害小老鼠的脑深部的一个显着的改善。

Protocol

1. 鼠标手术前的玻璃针：
   1. 放置在一个微量拉马的毛细玻璃管。
   2. 热中间的玻璃管，玻璃管软化局部区域。
   3. 由最初的距离，足以导致减少在玻璃管的直径在局部区域，沿其纵轴拉伸玻璃管。
   4. 保持伸展的玻璃管，直至其断裂。这样，两个相同的单管针头。
2. 放在microforge一个玻璃针。 30 °角是足​​够的锥尖。
3. 在显微镜下检查，每针具有正确的内径。对于大多数的亲水性药物，一个30-50微米的内径是理想的（图1）。
4. 从最广泛的玻璃针高端填充矿物油针。让，矿物油（MSDS，猫。M7700）通过毛细作用进入，直到达到〜50％的毛细管的长度。放入高真空润滑脂（道康宁，猫05054 - AB），周围的柱塞密封最广泛的针端。
5. 最广​​泛的针端插入柱塞推直到小滴的油被认为是走出去的玻璃针的尖端轻轻矿物油。
6. 安全中的微量持有人的玻璃针。
7. 麻醉用2.5％Avertin（2,2,2 - tribromoethanol +叔戊醇，1:1 W / V）的鼠标。 25 -30μLDosis每克腹腔。
8. 加热器垫放在立体定向设备，以保持动物的体温在37 ° C。
9. 地点和安全小鼠的头部立体定向设备使用耳酒吧和一个牙人。
10. 与0.1％葡萄糖酸氯己定溶液，70％乙醇和0.1％葡萄糖酸氯己定为第二次，清洁鼠标头。
11. 从小鼠耳外科手术的刀片＃15兰巴颅骨线切开皮肤。
12. 波兰与棉花交换干，拉皮肤手术领域的头骨。
13. 使用的玻璃针的尖端点前囟缝合的顶点。有你有设定的喷油器的初始位置（坐标“零”）。
14. 设置要通过移动的“X”和“Y”轴立体装置在颅骨钻点。
15. 非常仔细地孔钻在选定的坐标。 Microdrills和其他金属工具消毒，在250 ° C为60秒（科尔帕尔默，猫用一块干的玻璃珠灭菌。EW - 10779 - 00号）。
16. 用细镊子小心去除骨层最深打破duramatter膜（你会看到一些泄漏出来的脑脊髓液）。
17. 确认针可以通过钻孔。
18. 吸取1μL的药物要注入和小片上的封口膜。
19. 放在头骨上的封口膜。
20. 大吃纺纱微量轮的药物，当你在显微镜下检查，流体进入玻璃针。
21. 取出的封口膜，并重新设置为零坐标。
22. 针移动到选定的坐标下来的持有人，直到玻璃针的尖端轻轻触摸脑表面和定为零的“Z”的协调。
23. 在选定的深度引入脑实质的玻璃针。
24. 〜1 NL /秒的速率缓慢​​注入药物。
25. 当欲望体积注入到2分钟的实质，让药物弥漫。然后进行顺利，慢慢地取出针。
26. 胶的手术伤口和动物从立体设备中删除，并把含有麻醉恢复一个干净的床在预热笼动物。
27. 要提供手术后镇痛的所有动物酮咯酸5毫克/公斤皮下注射，每12小时24小时

代表性的成果：

下面的这个协议时，一个非常精确的注射是获得一个非常狭窄的针的轨道，最大限度地减少脑损伤。由于这种方法的一个代表性的结果，我们注入脱髓鞘脑白质大片1-4胼胝体产生溶血卵磷脂（溶血卵磷脂）。为了减少玻璃针所产生的脑损伤，我们注入的胼胝体只有20 NL溶血卵磷脂，但可以用同样的方法注射，如果需要更高的NL 200多卷。脱髓鞘缺席脑白质大片（图2）髓鞘碱性蛋白表达的检测。

图1：一个直径50微米的玻璃针。两个短的刻度之间的距离在规模代表50微米的长度。

图2。胼胝体的溶血卵磷脂注射。脱髓鞘显示为无髓鞘碱性蛋白表达（点区域）。注意小尺寸的玻璃针道（箭头）。酒吧= 100微米

Discussion

显示在这个视频的方法是非常有用的提供非常精确地进入大脑的药物或病毒载体最。这项技术的主要优势是可靠性的目标来看，注射的准确性和体积小的脑损伤和束^{损害1，2，5，6} 。一旦该技术是标准化的误炸范围50微米或小于^1，2。细胞移植也可以通过使用更宽，100-150微米^7-9，针。因此提供高效电池可存放到非常具体的病灶尽量减少抵押细胞移植引起的损伤。在这项技术的关键步骤有三个：

1. 我们始终建议抓胰岛素针钻前选定的坐标标签轻轻的头骨。
2. 介绍一个快速运动迅速渗入大脑表面的玻璃针。
3. 一旦达到最佳的深度，你应该引入脑实质有更深的“运河”，让药物可以自由扩散到大脑，使针0.1毫米。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary glass tube	Wiretrol I	5-000-1001
Micropipette puller	Kopf Instruments	Model 730
Microforge	World Precision Instruments, Inc.	Model 48000
Mineral oil	MSDS	M7700
High-vacuum grease	Dow Corning	05054-AB
Anesthesia: 2.5% Avertin			2,2,2-tribrom–thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v
Heater pad	Mastex	Model 900
Stereotactic device	Kopf Instruments	Model Kopf-900
Surgical scalpel blade # 15	Medi-Cut
Micro driller	Ideal Micro Drill	67-1000
Fine forceps	Fine Science Tools
1-μL Micropipette	Rainin
Parafilm M.
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	Vasiorkop with Contraves system
Microinjector	Narishige International	Model MO-10