Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Summary

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te volgen

Abstract

Hoge-resolutie time-lapse imaging van levende zebravis larven kan worden gebruikt om te visualiseren hoe biologische processen ontvouwen (voor review zie ^1). Samengestelde transgene vis die verschillende fluorescerende verslaggevers te uiten in de ons omringende celtypen een middel van het volgen van cellulaire interacties ² en / of weefsel-level reacties op experimentele manipulaties in de tijd. In deze video, tonen we aan methoden die gebruikt kunnen worden serieel voor beeldvorming meerdere transgenically gelabeld celtypes in de individuele vissen na verloop van tijd cursussen die kunnen variëren van minuten tot enkele dagen. De beschreven technieken zijn van toepassing op een studie die aan het "gedrag" van de naburige cellen types correleren loop van de tijd, zoals: 'catch and release' 1) seriële methode voor het afbeelden van een groot aantal vissen over opeenvolgende dagen, 2) in vereenvoudigde methoden voor het scheiden van fluoroforen met overlappende excitatie / emissie profielen (bijvoorbeeld GFP en YFP), 3) het gebruik van hypopigmented mutant lijnen uit te breiden het tijdvenster beschikbaar is voor hoge-resolutie beeldvorming in de late larvale stadia van ontwikkeling, 4) het gebruik van membraan gerichte fluorescente reporters om te onthullen fijne morfologische detail van individuele cellen als cellulaire details in grotere populaties van cellen, en 5) een eerder beschreven methode voor chemisch-geïnduceerde ablatie van transgenically gerichte celtypen, dat wil zeggen, nitroreductase (NTR) gemedieerde omzetting van prodrug substraten, zoals metronidazol (MTZ), voor cytotoxische derivaten ^3,5.

Als voorbeeld van deze benaderingen, zullen we visualiseren de ablatie en de regeneratie van een subtype van het netvlies bipolaire neuron in de individuele vissen over meerdere dagen. Tegelijkertijd zullen we monitoren een aantal andere retinale celtypen, waaronder naburige niet-gerichte bipolaire cellen en mogelijke degeneratie-gestimuleerde het netvlies stamcellen (dat wil zeggen, Mϋller glia). Deze strategie wordt toegepast in ons lab tot cel-en weefsel-niveau (bijvoorbeeld stamcel niche) reacties karakteriseren aan de selectieve verlies en regeneratie van gerichte neuronale celtypen.

Protocol

1. Transgene en Mutant Lines

1. Vestigen / verwerven transgene zebravis lijnen die celtypen van belang verschillend gelabeld met fluorescerende reporter varianten hebben. Optimaal, de excitatie / emissie profiel van de geselecteerde reporters moeten minimale overlap (bijvoorbeeld ECFP en EYFP), maar dit is niet absoluut nodig is. Voor onze doeleinden, het gebruik van membraan vastgebonden tl-reporters aanzienlijk vereenvoudigt beeldverwerking van fijne cellulaire details, zoals neuritische processen, op te lossen individuele cel nummers en / of morfologie in grote comingled groepen en naar regio's met hoge membraan content, zoals 'highlight' synaptische neuropils.
2. Voor de beeldvorming in de late larvale stadia, is het nuttig af te leiden / cross transgene lijnen in mutant achtergronden die pigmentvlekken te verminderen [bv, Roy Orbison (roy) of Roy Orbison, albino (roy, alb), ^4]. In onze ervaring, de vermindering van iridiphores (bijv. roy) is de meest kritische punt, kan melanogenesis worden aangepakt chemisch gebruik van 1-fenyl-2 thioureum (PTU) of met "albino" mutanten die melanoforen ontbreekt. Merk echter op dat Ren et al.. ^4, zijn visuele tekorten en bescheiden morfologische veranderingen in het netvlies van de vis ontbreekt melanaphores aangetoond, en dat intens licht kan fotoreceptor dood induceren in "albino" mutanten. Zo, deze kwesties moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen van imaging experimenten en / of interpreteren van gegevens.
3. Voor deze demonstratie, de transgene en mutant gebruikt vissen lijnen waren:
   1. Tg (NYX: Gal4-VP16) ^{q16a / +;} Tg (UAS: gap43-YFP) ^{q16b / +;} Tg (UAS-E1b: NfsB-mCherry) ^{c264 / +;} Tg (PAX6-DF4: gap43-CFP) ^{Q01 / +;} roy ^a9/a9
   3. Opmerking: In vissen "1", een subpopulatie van NYX-promotor gedefinieerd netvlies bipolaire cellen brengen een membraan-gelabeld YFP en / of een NTR-mCherry fusie reporter (meest express beide), en bijna alle netvlies cellen brengen een membraan-gelabeld GVB . Fish "2" zijn als hierboven, behalve Müller gliacellen te uiten cytosolische GFP en wereldwijde netvlies GVB uitdrukking is geëlimineerd. Expressie van het NTR-mCherry fusie maakt NYX gedefinieerde bipolaire cellen gevoelig voor prodrug-geïnduceerde ablatie ^3,5.

2. Het selecteren en voorbereiden van embryo's / larven voor Live Imaging

1. Mate transgene / mutant lijnen van belang, het verzamelen van eieren en incubeer / handhaven op 28,5 ° C in oplossing 0.3X Danieau's (of 'embryo medium' van de keuze).
2. Als dat niet in een "albino" achtergrond, moet PTU worden toegevoegd aan tyrosinase activiteit te remmen voordat enig bewijs van pigmentatie in het weefsel van belang (bijvoorbeeld, ~ 16 HPF voor het oog, 200 uM def.) Merk op dat de behandeling met PTU in concentraties van meer dan 75 uM kan toxiciteit en / of teratogene effecten veroorzaken. Echter, omdat het oog is zeer gepigmenteerde, behandelingen minder dan 200 uM zijn niet geschikt voor hoge-resolutie confocale imaging; onder deze omstandigheden is het belangrijk om te selecteren gezond uitziende vissen voor de beeldvorming. Voor de beeldvorming andere weefsels, kan 75 uM PTU de voorkeur. Ook, zoals hierboven aangegeven, gebruik van "albino" mutant lijnen ondervangt de noodzaak om embryo's te behandelen met PTU en is een aangewezen strategie voor de beeldvorming in de late larvale stadia.
3. Zodra TL-reporters zijn evident, een soort vis volgens de expressie en algemene gezondheid met behulp van een fluorescentie microscoop stereo zoom of dergelijke transgen.
4. Voorafgaand aan de eerste dag van de beeldvorming, te ontbinden low melt agarose (LMA) in embryo medium tot een uiteindelijke concentratie van 0,5%, warmte en meng tot in de oplossing, op te slaan krijgen bij 40 ° C.
5. Op de eerste dag van de beeldvorming, montage oplossing te bereiden: Voeg tricaïne (een verdoving, 756 uM definitief) en PTU (indien nodig) tot 0,5% LMA in embryo medium, meng, en keer terug naar 40 ° C.
6. Verdoven vis door de overdracht van in embryo medium dat PTU en / of tricaïne, voldoende tijd voor de vis niet meer reageert op aanraking (~ 3 min).
7. Overdracht individuele vissen in montage-oplossing, zorg ervoor dat u de agarose verdunnen, zodat het kan worden hergebruikt. We maken gebruik van een micropipet bijgesneden tip voor de overdracht, dit helpt ook het handhaven van een beheerste volume (~ 30 pi). Na het verwerven, omkeren pipet en laat de vis naar de bodem, zodat het aanraken van de tip om de montageoplossing zwaartekracht overdracht mogelijk zonder de noodzaak om een ​​vloeistof te verdrijven.
8. Na de overdracht, te verdrijven verdoving oplossing van micropipet en gebruik deze om de vis in een ~ 30 pi druppel bevestigingsoplossing op een petrischaal transfer.
   Opmerking: Deze montage methode is alleen relevant voor staande microscopie, waar lange-werkafstand onderdompeling in water doelstellingen zullen worden gebruikt. Voor mijthods die relevant zijn voor omgekeerde microscopen, waar dekglaasjes worden, zie Andersen et al., 2010;. O'Brien et al., 2009;. Graeden en Sive, 2009.
9. Keer terug bevestigingsoplossing op 40 ° C verwarmen blokkeren.
10. Met behulp van een borstel of een soortgelijke wimper voorzichtig zwenken vis in de gewenste richting en de positie van de regio van belang in het midden van de agarose druppel.
11. Herhaal de stappen 6 tot 10 tot het gewenste aantal embryo's per schotel te monteren. Voor seriële time-lapse experimenten (zie hieronder) hebben we meestal monteren zes vissen per keer en probeer imaging-sessies te beperken tot 1 uur per groep.
12. Terwijl de montage van andere vissen weer controleren om er zeker van vorige onderwerpen te behouden gewenste richting tot aan agarose stolt (~ 3 min).
13. Na de agarose is gestold, transport vis confocale microscoop stadium en zachtjes toe te voegen embryo medium dat PTU en / of tricaïne om de schotel totdat alle vissen zijn volledig ondergedompeld zijn.

3. "Multicolor" in vivo confocale Imaging

Opmerking: We hebben geprobeerd om het protocol te onder dusdanig dat het relevante informatie voor andere microscoop configuraties biedt generaliseren. Specifieke verwijzingen naar Olympus en ImageJ softwaretoepassingen tussen aanhalingstekens. Onze imaging-systeem is een Olympus FV1000 rechtop confocale microscoop uitgerust met een 405, 440, 488, 515, 559 en 635 nm lasers, twee variabele barrière filter detectie kanalen (waardoor emissie golflengte instellingen worden aangepast in stappen van 1 nm), een standaard barrière filter kanaal (voor rood en ver rood imaging), en een doorvallend licht kanaal.

1. Open de imaging software ("FV10-ASW") en gebruik ofwel overgedragen of TL-lichtbronnen in de regio van belang vinden. Voor een optimale beeldvorming van cellulaire en / of moleculaire details gebruik lange-werkafstand doelstellingen met een hoge NA (bijv. 60X, 1.2NA).
2. Als het verzamelen van doorgelaten licht beelden, de focus van de velddiafragma voor Kohler verlichting.
3. Kies de juiste fluorphores uit de "Dye List" of laden acquisitie parameters uit een eerder opgeslagen image bestand. Aanpassingen om de uitstoot reeksen ("Spectral Instelling") die nodig is voor schone scheiding van reporter signalen en / of maximale signaal-ruis verhoudingen. Deze instellingen moeten empirisch worden gedefinieerd voor elk experiment om overspraak te minimaliseren, maar optimaal signaal, de instellingen voor de voorbeelden hier gegeven worden hieronder weergegeven:

   Flourphores	Lasers (nm)	Barrier Instellingen / Emission Filter (nm)
   1) ECFP, EYFP, mCherry *	440, 515, 559 *	460-500, 530-545, 575-675
   2) EGFP **, EYFP **, mCherry	488, 515, 559	500-515, 530-545, 575-675

   
   * Beeldvorming van mCherry zou kunnen worden verbeterd met behulp van een hogere golflengte laser (bijvoorbeeld 568 of 594 nm)
   ** Een sequentiële imaging-modus waardoor dichroïde spiegel en barrière filter veranderingen ('virtuele kanalen') noodzakelijk is vanwege emissie / excitatie overlap tussen de GFP en YFP. GFP en mCherry kunnen worden toegewezen aan een kanaal, YFP naar een apart kanaal. Let op: overspraak tussen GFP en YFP beelden zullen duidelijk worden voorafgaand aan de Image Aftrekken (Deel 6).
4. Zorg ervoor dat het doel wordt gebruikt is geselecteerd in het drop down menu om alle software gedefinieerde voorinstellingen goed zijn afgesteld te verzekeren.
5. Om zich te concentreren lasers en stel vermogen, selecteert u een kijkje Up Table (LUT) die pixel verzadiging laat zien ("Hi-lo") voor elk kanaal. Set detector gevoeligheid ("HV", PMT voltage) om een ​​waarde in overeenstemming is met de gewenste beeldkwaliteit (empirisch gedefinieerd) en geleidelijk op tot laservermogen tot beeldintensiteit aanvaardbaar is te vermijden pixel verzadiging.
6. Controleer op overspraak tussen de kanalen, zorgen ervoor dat elke laserlijn detecteerbaar signaal produceert alleen in het juiste kanaal door handmatig te draaien lasers aan en uit, terwijl controle van alle beeldvorming kanalen. Te elimineren overspraak te verminderen laservermogen. Als er geen overspraak is evident, kan alle kanalen tegelijkertijd worden verworven en biedt aanzienlijke tijdsbesparing.
7. In het geval van onvermijdbare overspraak, gebruik dan een "Sequential" imaging-modus die schakelt tussen de lasers / kanalen individueel. Extreme gevallen (bijvoorbeeld, beeldvorming GFP en YFP) vereisen het gebruik van sequentiële modus, die ook switch dichroïsche spiegels en / of barrière filters ('virtuele kanalen'). Opmerking: deze optie brengt belangrijke tijdelijke vertraging in het beeld overnameproces en mogen niet worden appropriate voor het vastleggen van zeer dynamische processen.
8. "Zoom" en "Rotation" functies kunnen worden gebruikt voor de verdere kader op het gebied van belang. Zoom kan ook worden gebruikt om de beeldresolutie te verbeteren, tot aan de grenzen van het doel en de scan formaat dat gebruikt wordt (bijvoorbeeld 512 x 512, voor meer informatie over deze onderwerpen te zien, http://corefacilities.systemsbiology.net/imaging/documents/app_note_image_res . pdf).
9. Voor in vivo beeldvorming in het algemeen en van bijzonder belang voor time-lapse imaging technieken die fototoxiciteit onderwerpen (dat wil zeggen, ophoping van vrije radicalen) te minimaliseren moeten worden benadrukt; hoge scansnelheden (bv, 2 ps / pixel) en lage laser-uitgang niveaus (bijv. 1%) moet waar mogelijk worden gebruikt, evenals de laagste resolutie scan-formaat geschikt voor het vastleggen van opvallende informatie.
10. Ter verbetering van de beeldresolutie, scan-gemiddelde ("Kalman") kan gebruikt worden tijdens de acquisitie. Langzamere scansnelheden verbeteren ook de resolutie te verhogen, maar laser dwell time, die fototoxiciteit en bleken problemen zullen verergeren. Merk op dat beide benaderingen niet zijn ideaal voor time-lapse te wijten aan mogelijke onvermogen om snelle veranderingen vast te leggen over een z-serie, een fenomeen noemen we "de tijd vervagen". Merk op dat gemiddeld per lijn ten opzichte van frame kan helpen om "de tijd vervagen" kwesties te elimineren binnen een enkel vlak, maar niet over z-diepte.
11. Als signaal intensiteiten laag zijn en een maximale beeldresolutie is niet vereist (bijv., gewoon tellen cel nummers), het verhogen van de confocale diafragma (pinhole diameter) kan gebruikt worden om het signaal te versterken. Dit dient te houden laser intensiteiten laag, het verminderen van fototoxiciteit en bleken, maar het aanpassen van de diafragma een waarde groter dan een luchtig eenheid leidt tot een snelle verlies in beeldkwaliteit.
12. Definieer z-diepte-afmetingen met behulp van een snelle scan mode ("Focus x4"). Omdat de intensiteit van het signaal over het algemeen afneemt met de z-diepte is het best om z-stack overnames te starten tegen de laagste diepte en eindigen bij de meest oppervlakkige, dit maakt het moeilijker signalen over te nemen voordat belangrijke bleken optreedt.
13. Controleer of er voldoende signaal detectie door de diepte van het beeld. Indien gewenst kan een z-dimensie helderheid correctie functie ("Bright Z") worden gebruikt om de afbeelding acquisitie parameters aan te passen op bepaalde dieptes.
14. Stel de z-dimensie stapgrootte op basis van experimentele behoeften. Bijvoorbeeld, in ons eerste voorbeeld (figuur 1) waren we alleen maar het nemen van een 'cel volkstelling' in individuele netvlies over opeenvolgende dagen, dus hebben we de z-diepte ingesteld op 15 micron en vijf tot zeven beelden nam per netvlies. Deze strategie liet ons toe om elk netvlies monster met geen cellulaire overlap tussen de beelden. In ons tweede voorbeeld (figuur 2), voerden we een snelle 4D time-lapse filmpjes waarin de GFP en mCherry signalen die nodig zijn in ruimtelijke zin worden gecorreleerd, waardoor we de stap grootte in te stellen tot drie keer de theoretische laterale resolutie een compromis dat z-stack afbeeldingen toegestaan die moeten worden genomen elke 5-10 minuten, maar nog steeds wordt gevoerd aan de individuele cellulaire detail op te lossen.
15. Acquire foto's ("XYLZt") en op te slaan. Ga verder naar de volgende vissen als het uitvoeren van een seriële time-lapse experiment (zie # 4 hieronder). Voor een snelle time-lapse imaging zien # 5 hieronder.

4. Serial 'Catch and Release' Imaging: een methode voor Tracking cellulaire veranderingen in individuele Fish over opeenvolgende dagen

1. Een 'catch and release' protocol wordt gebruikt om de hoeveelheid tijd die vis te minimaliseren worden geïmmobiliseerd en het aantal vissen afgebeeld per experiment te verhogen. Het nut van deze techniek is beperkt tot de biologische processen die zich ontvouwen gedurende dag (bijvoorbeeld, Mumm et al.. 2006 ^2). Een voordeel van deze aanpak is dat het kan elke waargenomen veranderingen worden intern gecontroleerd, dwz vergelijkingen tussen verschillende staten van individuen in plaats van heel de bevolking. Bijvoorbeeld, het bijhouden van wijzigingen in het aantal gelabelde cellen aanwezig zijn in een bepaald weefsel nauwkeurig kan worden uitgevoerd, zelfs als het aantal cellen in eerste instantie gelabeld varieert sterk tussen individuele vissen. Methoden voor het gebruik van dit protocol in het kader van een prodrug-geïnduceerde cel ablatie assay ^3,5 worden hier gegeven.
2. Te visualiseren van de ablatie en regeneratie van gerichte celtypes in de individuele vissen na verloop van tijd, zijn confocale beelden aangekocht vóór prodrug administratie (Pre-behandeling), onmiddellijk na het verwijderen prodrug (Post-behandeling) en gedurende de herstelperiode (Recovery beelden).
3. Voorbehandeling beeldvorming: Vis zijn gemonteerd en afgebeeld, zoals hierboven. Zodra vissen zijn afgebeeld ze worden vrijgelaten in embryo medium (+ pro-drug) en geïncubeerd bij 28,5 ° C tot de nabehandeling imaging sessie. Werken in teams van twee, een montage en het vrijgeven van vis, de andere imaging is een goede manier om het aantal vissen dat kan worden afgebeeld per dag te maximaliseren.
4. Na de beeldvorming alle vissen in een schotel vervanging van de embryo medium met tricaïne met embryo's alleen medium (+ / - PTU).
5. Vrij te vissen, te gebruiken juweliers tang om door agarose snijden aan beide zijden van de larven en dan zachtjes weg te pesten agarose tot de vis zweeft vrij in embryo medium.
6. Prodrug-geïnduceerde ablatie: Transfer larven in een afzonderlijk goed van een multiwell plaat met embryo medium (+ / - PTU) + pro-drug (bv 10 mM metronidazol, MTZ). Om een ​​nauwkeurige laatste prodrug concentraties ervoor zorgen dat we meestal hoeveelheid een welomschreven deel van embryo medium (+ / - PTU) met een 2X concentratie van pro-drug (bv 20 mm) in elk putje. Vissen worden dan toegevoegd aan putten in een gelijk volume van embryo medium (+ / - PTU) om de uiteindelijke prodrug-concentratie naar 1x.
7. Incubeer bij 28,5 ° C tot gerichte cel ablatie kan worden geverifieerd.
   Let op: Prodrug behandelingen nodig zijn om een ​​succesvolle ablatie te bereiken is afhankelijk van de beoogde celtype, prodrug concentratie en duur van de behandeling moet empirisch worden bepaald, rekening mee dat hoge concentraties algemene toxiciteit, bijvoorbeeld> 10 mM MTZ veroorzaken. Daarnaast kan perdurance van gefragmenteerde reporter signalen bemoeilijken de beoordeling van ablatie succes, in sommige gevallen confocale microscopie is nodig om adequaat te visualiseren cel verlies.
8. Post-behandeling beeldvorming: Vissen zijn gemonteerd, dat het hetzelfde weefsel optimaal georiënteerd en afgebeeld, zoals hierboven. Zodra alle vis op een bepaalde plaat zijn afgebeeld ze worden vrijgelaten in embryo medium (+ / - PTU) in individuele bronnen (zoals hierboven) en geïncubeerd bij 28,5 ° C tot regeneratie van de geablateerd celtype mogelijk te maken.
9. Afhankelijk van de leeftijd van de vis en de tijd die nodig is voor herstel, kan het nodig zijn om visvoer in deze fase van de test. We maken gebruik van levend voedsel, zoals pantoffeldiertjes of raderdiertjes om een ​​optimale overlevingskansen te verzekeren. Het is ook raadzaam om dagelijks voer verse media, met name als vissen worden onderhouden in lage volumes (bv. platen met 96 putjes).
10. Herstel beeldvorming: Om de kinetiek van de cel vervangend document, kunt vissen worden afgebeeld op een dagelijkse basis gedurende de herstelperiode. Zodra de kinetiek zijn vastgesteld de test kan worden vereenvoudigd door het verwerven van herstel alleen afbeeldingen op het moment points of interest (bijv. volledig herstel). Figuur 1 geeft een voorbeeld van deze aanpak uit onze studies van retinale cel regeneratie.
11. Aan het einde van het experiment vissen moeten worden gedood door onderdompeling in 20X tricaïne (15,3 uM) oplossing op ijs.

5. Een snelle Time-lapse Imaging.

1. Voor een snelle time-lapse imaging (dat wil zeggen, 'films') van meerdere fluorphores, technieken die fototoxiciteit problemen te minimaliseren kritisch zijn (zie hierboven). Zoals hierboven vermeld, is deze techniek het meest geschikt voor fluorphores waardoor gelijktijdige, in plaats van sequentieel, imaging
2. Handhaaf vis op 28,5 ° C met behulp van een verwarmde podium, ITO glas verwarmingselement, of iets dergelijks.
3. Gebruik methoden die de verdamping te verminderen om te helpen temperatuur en de osmolariteit te stabiliseren (bijvoorbeeld o-ring afgedicht dekglaasjes voor omgekeerde microscopen).
4. Bij gebruik van geautomatiseerde acquisitie gedurende langere tijd moet u eerst de stack grootte in te stellen om te zorgen voor groei en / of drift in de z-dimensie.
5. Stel tijdsintervallen en het aantal scans ("TimeScan" of "TimeController"). Overname tarieven zal moeten empirisch worden vastgesteld volgens de dynamiek van het biologische proces afgebeeld en / of aangepast volgens de gevoeligheid fototoxische eigenschappen van de cel bevolking van belang.
6. Acquire foto's ("XYLZt" knop) en op te slaan.
7. Te construeren 'movies', zal gebieden die van belang moeten worden gedefinieerd en afgestemd op de x, y en z afmetingen. Het volledige proces valt buiten het bestek van dit protocol herzien, maar verschillende software programma's beschikbaar die ook inzoomen, roteren en pannen functies te vergemakkelijken tijdens de 4D afbeelding montage (Volocity, Amira, etc.).

6. Spectral Scheiding Image Processing met ImageJ Freeware

1. Optimaal, bij het uitvoeren van een multi-reporter imaging experiment is het het beste om te gebruiken fluorphores die goed spectraal worden gescheiden. Echter, dit is niet altijd praktisch en / of mogelijk is. Hier geven we een vereenvoudigde methode voor het scheiden van fluorphores die overlappende excitatie en emissie profielen, in dit geval GFP en YFP. In de verstrekte voorbeeld, hebben we gebruik gemaakt van de time-lapse beeldvormende technieken hierboven beschreven het gedrag van de GFP-gelabelde het netvlies 'stamcellen', Müller glia track, tijdens de gerichte ablatie en regeneratie van het netvlies bipolaire cellen gelabeld met YFP en NTR-mCherry (figuur 2).
2. Verzamel beelden met behulp van sequentiële beeldvorming modes en variabele barrière filters die het mogelijk maken overlappende fluoroforen om zelfstandig te worden verworven en deels gescheiden, respectievelijk (zie hierboven voor GFP / YFP instellingen bijvoorbeeld). Voor het verwijderen van overspraak wij gebruik van een eenvoudige afbeelding aftrekking strategie, die een signaal van een andere kanalen verwijderd.
3. Afbeelding Aftrekken Proces: Install de laatste versie van ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/notes.html), Loci Bio-Formats tool (http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej) , en lijn stapels plug-in (http://www.med.harvard.edu/JPNM/ij/plugins/Align3TP.html).
4. Gebruik de Loci Bio-Formats Import plug-in om de afbeelding bestanden te openen, gewoon slepen het dossier van belang op het ImageJ venster zal de import tool te starten. Splits de kanalen in afzonderlijke stapels met behulp van de "Split Channels" checkbox in de import venster of de "Split Channels" tabblad onder "Channel Tools" (shift + ctrl + z) na het laden.
5. Start de Lijn 3 TP plugin (plugins> Uitlijnen stapels> Lijn 3 TP). De stapels moeten worden afgestemd om een ​​goede aftrekken te garanderen. Selecteer de referentie-stack in de eerste dropdown box en de mis-uitgelijnde stapel in de tweede. Controleer het "gebruik xy relatieve oorsprong" en "gebruik z relatieve oorsprong" dozen en klik op "OK".
6. Om te beginnen met het uitlijnen, klikt u op de "Volume Registratie" te klikken. Een nieuw venster zal verschijnen met daarin de uitlijning parameters. Dit gedeelte is geoptimaliseerd door de distributeur van de plugin, geen wijzigingen nodig zijn, klikt u op "OK".
7. Wanneer u klaar bent, zal een "Aligned Stacks" venster verschijnt. Selecteer "Output" van de Lijn venster en het venster Output moeten verschijnen. Dit venster is ook geoptimaliseerd en behoeft geen wijziging. Klik op "OK". Een nieuwe stapel moet worden weergegeven in de werkruimte met "Aligned" toegevoegd aan het einde van het bestand titel.
8. Overspraak zullen worden verwijderd met behulp van de "Image Calculator" (Process> image Calculator). Selecteer de stapel te worden afgetrokken in het Image1 dropdown box en de stapel die in het aftrekken in het Image2 dropdown box. Selecteer "Trek" in de operatie uitklapmenu en klik op "OK". ImageJ zal vragen om de stapel proces, selecteert u "Ja". Een nieuwe stapel moet verschijnen die de overspraak tussen overlappende kanalen verwijderd.
9. Om een ​​zelfde opname-structuur opnieuw voor de uitlijning en aftrekken Stacks moeten worden samengevoegd. Selecteer "Samenvoegen Channels" in het Kanaal Tools venster. De tool stelt u in staat om maximaal samen te voegen tot vier stapels in een HyperStack.
   Opmerking: Als u meer dan 4 stapels, stapels samenvoegen samenvoegen in de gewenste volgorde met het aaneenschakelen gereedschap (foto's> stapels> tools> samenvoegen). Zet de samengevoegde stapel een HyperStack (foto's> HyperStack> stack HyperStack). Aaneenschakeling van de stapels verandert de diepte, tijd, kanaal (zct) bestellen, dit moet worden gereset in de dropdown box die verschijnt, zet u "orde" te xyztc, stelt u "kanalen", "plakken" en "frames" volgens de aantal stapels, diepte van de stapel en het aantal tijdstippen, respectievelijk ..
10. Tot slot, alle kanalen moeten worden ingekleurd, gecorrigeerd voor helderheid en contrast, en opgeslagen als TIFF-bestanden. Vanaf hier, conversie naar RGB, montage, z-projectie, of tijdreeksen is hetzelfde proces als bij de originele bestanden.

7. Representatieve resultaten

Figuur 1. Een time-lapse serie van confocale beelden tonen gerichte verlies en regeneratie van de NTR-mCherry expressie netvlies bipolaire cellen (rode cellen). A & A ') Voorafgaand aan de behandeling is er mozaïek expressie van membraan-tagged YFP reporter in "control" bipolaire cellen, in het geel weergegeven, en nitroreductase-Cherry fusie-eiwit in de "gerichte" bipolars rood weergegeven. B & B ') Na de behandeling met metronidazol, de rode nitroreductase expressie bipolaire cellen, verloren zijn gegaan, terwijl de gele "control" bipolaire cellen worden gespaard. Dit toont de zeer specifieke karakter van deze ablatie methodologie. C & C ') Wanneer metronidazol wordt verwijderd, NTR-expressie (rode) cellen terug te keren.

Figuur 2. Geeft een voorbeeld van de afbeelding aftrekken proces waarmee GFP en YFP te netjes worden gescheiden na de overname. A & A ') Voorafgaand aan aftrekken, de GFP (groen) en YFP (pseudocolored paars) beelden worden uitgelijnd. B & B ') De aftrekken proces maakt het mogelijk YFP-label bipolaire cellen worden verwijderd uit de GFP beeld, waardoor GFP-gelabelde Müller glia gemakkelijker worden opgespoord. C & C ') Co-expressie van GFP (groen) en mCherry (rood) is duidelijk in de cel door de pijl aangegeven. Omdat Co-expressie van de Müller glia cel marker en een bipolaire cel marker suggereert dat een bipolaire cel ablatie triggers Müller glia om de verloren cellen te vervangen. Deze interpretatie is in overeenstemming met recente studies van het netvlies regeneratie die Müller glia impliceren als letsel-geïnduceerde 'stamcellen' in zowel de zoogdieren en vissen.

Discussion

In deze video, is een overzicht van de technieken die we gebruiken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Wij gebruiken time-lapse imaging om het gedrag van meerdere celtypen van interesse in vivo monitor, terwijl de gerichte cel ablatie wordt gebruikt om de neurale circuit functie en cel-specifieke neuronale regeneratie paradigma's te bestuderen. De getoonde voorbeelden benadrukken diverse voordelen die kunnen worden afgeleid uit deze benaderingen. Misschien wel het meest belangrijke, time-lapse imaging biedt een intern gecontroleerde paradigma, waargenomen alle verschijnselen kunnen worden gerelateerd aan de vorige staten. Dit maakt directe in plaats van afgeleid vergelijkingen te maken tussen experimenteel tijdstippen, waardoor de relatieve veranderingen makkelijker te kwantificeren en het verminderen van experimentele 'ruis' geassocieerd met variaties binnen een populatie. Een voordeel van multicolor beeldvorming is de mogelijkheid om veranderingen in de interactie en / of de naburige celtypen te visualiseren. Bijvoorbeeld, het gebruik van een transgene lijn die Müller glia labels, zijn we nu het karakteriseren van de respons van deze potentiële verwonding veroorzaakte stamcellen om het verlies van discrete netvlies cel subpopulaties. We hebben ook gebruik gemaakt van deze aanpak om nieuwe mechanismen van neurale circuit de vorming ² te definiëren. Tot slot, in aanvulling op studies van cellulaire regeneratie, hebben we onlangs begonnen met het gebruik van de NTR-based ablatie systeem om de functionele rol van neuronale subtypes dus discrete neurale circuits met behulp van verschillende paradigma's gedragsmatige en elektrofysiologische testen te onderzoeken. Het unieke voordeel van de tewerkstelling van de zebravis voor dergelijke studies is dat te wijten aan hun regeneratievermogen, veroorzaakte tekorten tijdelijk zijn. Dus, door correleren met time-lapse imaging assays kunnen we typeren reïnnervatie mechanismen die leiden tot, evenals de mate van reïnnervatie nodig is voor, functioneel herstel.

Op voorwaarde dat de methoden kunnen worden aangepast aan de vele verschillende vragen. Bijvoorbeeld, kunnen vergelijkbare analyses van ablatie en regeneratie worden toegepast op elke transgenically definieerbare cellulaire subtype. Gezamenlijk worden deze studies hebben het potentieel om ons begrip van de regeneratie uit te breiden op het niveau van de individuele celtypen en binnen de discrete stamcellen niches.

Materials

1. Reagents:

Danieau's solution:

sodium chloride (Fisher, S271 1) potassium chloride (Fisher, P217 500) HEPES (Fisher, BP310500) magnesium sulfate (Fisher, M65 500) calcium nitrate (Fisher, C109500) Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049)

Other reagents:

Low melt agarose (Fisher, BP165-25) Tricane methanesulfonate (Fisher, NC9435281) N-phenylthiourea (Fisher, NC9968868) Metronidazole (Fisher, AC21034-1000)

2. Supplies:

Deep petri-dishes (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32) Dumont #5 fine forceps (Fisher, NC9404145)

3. Equipment:

Zoom Stereoscope (Olympus, SZ51) Fluorescence Zoom Stereoscope (Olympus, SZX16) Confocal microscope (Olympus FV1000) Digital block heater - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) Barnstead/Thermolyne Benchtop Incubator (Fisher, 11-702-4).