Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम एक नई विधि का वर्णन करने के लिए एक साथ अक्षतंतु विकास पर glial सेल विविधता के प्रभाव का अध्ययन
Abstract
सभी स्तनधारियों की केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में चोट के बाद कटे axons करने के लिए अपने मूल लक्ष्य और कार्यात्मक वसूली को पुनर्जीवित करने में असमर्थ रहे हैं बहुत ही गरीब है 1. अक्षतंतु उत्थान की विफलता glial सेल शत्रुतापूर्ण वातावरण, निरोधात्मक माइलिन संबंधित अणुओं और आंतरिक न्यूरॉन पुनर्योजी 2 क्षमता कम सहित कई कारकों के एक संयुक्त परिणाम है. Astrocytes सबसे प्रमुख केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में glial सेल प्रकार के होते हैं और अक्षतंतु कार्यों में शरीर विज्ञान और विकृति तीन शर्तों के तहत महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . मुताबिक़ oligodendrocytes कंट्रास्ट, astrocytes एक विषम सेल जनसंख्या विविध morphologies और जीन अभिव्यक्ति 4 के साथ विभिन्न astrocyte subpopulations द्वारा रचित हैं . इस विविधता के कार्यात्मक महत्व अक्षतंतु विकास पर उनके प्रभावों के रूप में, काफी हद तक अज्ञात है.
Glial सेल, विशेष रूप से न्यूरॉन व्यवहार में astrocyte विविधता के समारोह का अध्ययन करने के लिए, हम उच्च सह - संवर्धन चूहा प्रांतस्था से प्राप्त glial कोशिकाओं के साथ शुद्ध पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स द्वारा एक नई विधि की स्थापना की. इस तकनीक के द्वारा, हम करने के लिए सीधे एक ही शर्त के तहत विभिन्न astrocytes subpopulations पर न्यूरॉन आसंजन और अक्षतंतु विकास की तुलना में सक्षम थे.
इस रिपोर्ट में, हम astrocytes अलगाव और संस्कृति, पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स अलगाव और शुद्धि, और astrocytes के साथ न्यूरॉन्स DRG की सह - संस्कृति के लिए इस विधि की विस्तृत प्रोटोकॉल दे. इस विधि को भी अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए बढ़ाया जा सकता है सेलुलर या क्षेत्रीय न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के बीच विशेष बातचीत का अध्ययन.
Protocol
1. Glia सेल संस्कृति
Glial कोशिकाओं केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिन्न क्षेत्रों से संवर्धित किया जा सकता है है. पूरी प्रक्रिया की प्रक्रिया के आंकड़े में दिखाया गया है.
दिवस 1 कोटिंग संस्कृति की थाली और coverslips
- ड्राई निष्फल ग्लास खुर्दबीन दौर एक autoclave में coverslips.
- प्लेट निष्फल संस्कृति 24 अच्छी तरह से थाली में निष्फल coverslips.
- कोट पाली lysine और जड़ तापमान के तहत 2 घंटे के लिए सेते साथ coverslips.
- कोट 6 अच्छी तरह से चरण 3 के रूप में एक ही रास्ते में संस्कृति प्लेटों.
- आसुत जल और संस्कृति हुड में शुष्क हवा के साथ coverslips और 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली दो बार से धो.
- 6 अच्छी तरह से थाली में 24 अच्छी तरह से थाली और प्रत्येक कुएं में 2 एमएल में प्रत्येक अच्छी तरह में 200 μL DMEM मध्यम (10% FBS के साथ) और जोड़ें उन्हें इनक्यूबेटर में डाल 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री के नीचे
2 दिन अलग प्रांतस्था और glial सेल संस्कृति
- सकारात्मक प्रवाह विच्छेदन हुड जीवाणुरहित.
- 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर मुड़ें.
- 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों स्प्रे और उपयोग करने से पहले 15 मिनट रुको.
- तनाव को बदलने: anesthetize चूहे द्वारा हाइपोथर्मिया (P2-P6) पिल्ले, और framen मैग्नम ऑपरेटिंग कैंची का उपयोग के आधार पर सिर काटना.
- बाण के समान एक परितारिका और खोपड़ी बंद कैंची छील का उपयोग सीवन के साथ cranium खोलें.
- अग्रमस्तिष्क निकालें और उन्हें ठंडा l15 मध्यम में stereomicroscope तहत डाल करने के लिए, ध्यान से रक्त वाहिकाओं के साथ dura और पिया झिल्ली को साफ, प्रांतस्था अलग और l15 के माध्यम से कई बार धोने.
- प्रांतस्था microsurgery कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में काटें.
- 0.125% trypsin EDTA प्रांतस्था टुकड़े और सेते में l15 के माध्यम से 15 मिनट के लिए 37 डिग्री में तैयार जोड़ें.
- 20ml DMEM मध्यम में ऊतक ब्लॉक 50ml ट्यूब में 20% FBS के साथ स्थानांतरण, अंतिम एकाग्रता 10ug/mL DNase शेयर समाधान जोड़ने के लिए, ऊतक समाधान ऊपर aspirate और नीचे आग पॉलिश कांच Pasteure विंदुक के साथ 20 बार के लिए, एकल कक्षों निलंबन इकट्ठा.
- सेल निलंबन के साथ एक समय धो DMEM मध्यम, फिर से निलंबित DMEM में 10% FBS के साथ कोशिकाओं के लिए, 5000-10000/cm 2 में खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं hemocytometer, बीज कोशिकाओं के साथ गिनती. एक 37 डिग्री के 5% इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, प्रति सप्ताह मध्यम 2 बार के आधे बदल जाते हैं.
2. पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स अलगाव, संस्कृति और शोधन
1 दिन संस्कृति सामग्री तैयार
- कोट के साथ दो बार पाली lysine, धोने coverslips के साथ निष्फल coverslips गढ़ने पानी और शुष्क हवा, उन्हें 24 अच्छी तरह प्लेटों में डाल दिया.
- 2 B27% और 2.5S NGF (50 एनजी / एमएल) के साथ 100μL Neurobasal मध्यम जोड़ें, 37 डिग्री 5% सीओ 2 में थाली डाल दिया .
2 दिन भ्रूण से DRGs पृथक करें
- Glial सेल संस्कृति के रूप में एक ही रास्ते में प्रवाह हुड निष्फल.
- अधिक मात्रा द्वारा सीओ 2, 70% इथेनॉल द्वारा निष्फल पेट के साथ एक गर्भवती चूहा (E15) euthanize, भ्रूण गर्भाशय से अलग थे और ठंडा l15 मध्यम में डाल दिया.
- जुड़ा stereomicroscope और हस्तांतरण के तहत पृष्ठीय रूट ठंडा l15 मध्यम के साथ 35 मिमी व्यंजन ganglia के साथ रीढ़ की हड्डी डोरियों पृथक.
- एकल कक्ष निलंबन लीजिए और NBF मध्यम (Neurobasal मध्यम 2 B27% और 2.5S NGF (50 एनजी / एमएल) युक्त) के साथ एक बार धोने.
3 दिन शुद्ध DRG न्यूरॉन्स
- 18h-24 न्यूरॉन बोने के बाद, न्यूरॉन संस्कृति को 20 सुक्ष्ममापी और 200 μL के अंतिम मात्रा के अंतिम एकाग्रता के लिए एक 1 मिमी केंद्रित FUDR शेयर समाधान जोड़ने.
- 72h बाद, आधा Neurobasal FUDR बिना 2 B27% और 2.5S NGF (50ng/mL) युक्त मध्यम के साथ मध्यम जगह. उसके बाद, हर दूसरे दिन मध्यम बदल जाते हैं.
3. Glial कोशिकाओं के साथ coculture DRG न्यूरॉन्स
- जब glial सेल संस्कृति संगम (बोने के बाद 20 दिनों के चारों ओर) तक पहुँच, वे न्यूरॉन्स के साथ coculture के लिए तैयार थे.
- शुद्ध न्यूरॉन्स को जोड़ने से पहले 24 घंटे, glial कोशिकाओं मध्यम Neurobasal 2 B27% और 2.5S NGF (50 एनजी / एमएल) युक्त माध्यम से बदल रहे थे.
- शुद्ध न्यूरॉन्स संस्कृति कुओं से एकत्र किए गए थे, एकल कक्षों निलंबन आग पॉलिश Pasteure विंदुक के माध्यम से यांत्रिक गुजर द्वारा प्राप्त किया गया.
- संख्या की गणना करने के बाद, न्यूरॉन्स 2 500/cm पर मिला हुआ glial कोशिकाओं पर Neurobasal मध्यम में 2% B27 और 2.5S NGF (50ng/mL) युक्त वरीयता प्राप्त थे.
- न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं पर neurite विकास आसंजन और दर्ज किया जा सकता है छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर और immunocytochemistry सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर के द्वारा अलग अलग समय बिंदुओं पर विश्लेषण.
4. प्रतिनिधि परिणाम
- Glial सेल संस्कृति: बोने के बाद 20 दिनों के आसपास glial कोशिकाओं मिला हुआ हो जाएगा . चरण विपरीत microsc के तहतope, यह आसानी से पहचान की थी कि morphological अलग glial सेल subpopulations विभिन्न विकास पैटर्न substructures के गठन और GFAP सकारात्मक astrocytes अधिक से अधिक 90% के लिए जिम्मेदार के रूप में immuocytochemisty तकनीक (चित्रा 1, चित्रा 2) द्वारा दिखाया गया है.
- DRG संस्कृति न्यूरॉन्स: हमारे विधि में, 72 घंटे FUDR उपचार के बाद, DRG न्यूरॉन्स की शुद्धता के रूप में 99% के रूप में उच्च के रूप में 6 दिनों के भीतर पहुंच जाएगा, DRG न्यूरॉन्स उनके अद्वितीय morphologies दिखाया और उच्च घनत्व neurite विकास (चित्रा 3, चित्रा 4) के साथ.
- Glial सेल और न्यूरॉन्स coculture: DRG न्यूरॉन्स आसंजन और neurite परिणाम बोने के बाद चार घंटे के भीतर glial कोशिकाओं पर आसानी से हुई, सावधान टिप्पणियों से पता चला है कि न्यूरॉन आसंजन और neurite विकास glial सेल subpopulations है जो विशेष विकास पैटर्न substructures का गठन से प्रभावित थे, यह आसानी से पहचाना जा सकता है चरण विपरीत खुर्दबीन के नीचे और immunocytochemistry (चित्र 5, चित्रा 6).
चित्रा 1. मिला हुआ glial कोशिकाओं की आकृति विज्ञान cortical glial कोशिकाओं. Polylysine लेपित coverslip पर चढ़ाया गया और 20 दिनों के लिए सभ्य, glial कोशिकाओं के विभिन्न विकास पैटर्न नोट करने के लिए, बाईं ओर की कोशिकाओं को एक विकिर्ण रास्ते में व्यवस्थित.
चित्रा 2. Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन एंटीबॉडी (GFAP) द्वारा लेबल मिला हुआ glial कोशिकाओं. GFAP (लाल) के सही पक्ष पर सकारात्मक कोशिकाओं के विकिर्ण व्यवस्था ध्यान दें .
चित्रा 3. पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स FUDR उपचार के बिना इन विट्रो में वृद्धि हुई contaminating कोशिकाओं को न्यूरॉन्स पृष्ठभूमि DRG का गठन किया था..
चित्रा 4. पृष्ठीय रूट ganglia न्यूरॉन्स FUDR उपचार के बाद इन विट्रो में वृद्धि हुई पृष्ठभूमि contaminating कोशिकाओं को पूरी तरह से सफाया किया गया था ..
चित्रा 5. पृष्ठीय रूट ganglia glial कोशिकाओं पर हो न्यूरॉन्स न्यूरॉन्स आसंजन और neurite विकास निकलने की व्यवस्था की कोशिकाओं पर हिचकते थे और सही पक्ष glial कोशिकाओं पर सीमित.
चित्रा 6. पृष्ठीय रूट ganglia neurofilament एंटीबॉडी द्वारा लेबल glial कोशिकाओं पर बढ़ती न्यूरॉन्स. Neurite (हरा) विकिर्ण व्यवस्था बाईं ओर glial कोशिकाओं पर हिचकते थे और सही पक्ष पर सीमित, सभी glial कोशिकाओं GFAP एंटीबॉडी (लाल) के द्वारा लेबल थे .
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Discussion
इस प्रयोग प्रोटोकॉल glial कोशिकाओं, न्यूरॉन आसंजन और neurite विकास पर विशेष रूप से astrocyte विविधता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दो लक्ष्यों तक पहुंचने के लिए डिजाइन किया गया था. पहला लक्ष्य astrocyte जितना संभव हो इस प्रयोग में विविधता है, को बनाए रखने के लिए गया था, मिला हुआ glial सेल संस्कृति समृद्ध astrocytes बिना किसी भी रासायनिक उपचार और पाचन प्रसार, जो आगे कोशिका क्षति हो सकता है और astrocytes की चोट प्रतिक्रिया प्रेरित प्राथमिक संस्कृति मिश्रित था. अंतिम astrocyte शुद्धता अधिक से अधिक 90% GFAP सकारात्मक है, संदूषण fibroblasts के साथ कम से कम 1% के रूप में fibrobasts FN द्वारा सत्यापित. शुरुआत की कोशिकाओं को कम बोने घनत्व संगम से पहले विभाजन के कई दौर से गुजरना. चरण विपरीत खुर्दबीन के तहत, glial सेल विविधता अलग morphological अलग astrocytes द्वारा गठित बुनियाद द्वारा मनाया गया. दूसरा गोल करने के लिए उच्च शुद्ध DRG न्यूरॉन्स मिल गया था और उन्हें glial कोशिकाओं के साथ न्यूरॉन व्यवहार पर विविधता के प्रभाव का अध्ययन coculture. जाहिरा तौर पर प्रभावित कोशिकाओं जैसे fibroblasts और श्वान कोशिकाओं पृष्ठीय रूट ganglia में contaminating या बदल सकता है संस्कृति शर्तों 5, 6 में अक्षतंतु विकास, इस अनचाहे प्रभाव से बचने, न्यूरॉन्स DRG सीरम मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत थे और 72h के लिए FUDR द्वारा इलाज सबको मार अन्य प्रकार की कोशिकाओं. इस उपचार के बाद, DRG न्यूरॉन्स के रूप में 99% के रूप में उच्च के रूप में शुद्ध किया जा सकता है. यह पारंपरिक विधि है जो न्यूरॉन्स संस्कृति 7 कई बार इलाज की जरूरत है की तुलना में अधिक कुशल था. सिंगल DRG न्यूरॉन आसंजन और अक्षतंतु विकास और आसानी से हो सकता है और निगरानी सकता है समय चूक रिकॉर्डिंग और इमेजिंग विश्लेषण विधि द्वारा चरण विपरीत खुर्दबीन के नीचे ट्रैक, glial कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत immunocytochemistry और इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप तकनीक द्वारा विवरण में विश्लेषण किया जा सकता है.
यह नोट किया गया था है कि DRG न्यूरॉन्स अधिक से अधिक 4 हफ्तों के लिए इन विट्रो में नहीं रखा जा सकता है, उनके अस्तित्व में कमी के कोई संकेत नहीं था, लेकिन वे अब किसी भी सब्सट्रेट करने के लिए पालन नहीं कर सकता है, आम तौर पर वे अलग और ऊपर रोल होगा.
DRG न्यूरॉन्स एक लंबे समय के लिए astroglial कोशिकाओं (अधिक से अधिक 2 महीने) पर रखा जा सकता है. उच्च शुद्ध DRG न्यूरॉन्स और astrocytes के बीच यह लंबी अवधि के coculture एकल और अधिक आसानी से astrocytes के विभिन्न प्रकार पर अक्षतंतु विकास न्यूरॉन्स की ट्रैकिंग, यह भी पृष्ठीय रूट ganglia में अन्य संदूषण कोशिकाओं से अनियंत्रित प्रभाव से बचने के. पूरी संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, सभी कक्षों को ध्यान से संभाला जाना चाहिए और सभी कोशिकाओं को हमेशा मध्यम संस्कृति में डूब जाना चाहिए. उच्च शुद्धता DRG न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए, एक महत्वपूर्ण बिंदु FUDR उपचार की अवधि है, 72h से अधिक उपचार काफी सेलुलर व्यवहार्यता और कम समय के उपचार समझौता सभी संदूषण की कोशिकाओं को मारने नहीं हो सकता है. इष्टतम स्थिति में, हम एक सप्ताह के भीतर उच्च शुद्धता DRG न्यूरॉन्स की बड़ी राशि प्राप्त कर सकते हैं. इस coculture प्रणाली का उपयोग, हम में पाया गया कि सामान्य रूप से आयोजित की मान्यताओं के विपरीत में, विषम astrocytes न्यूरॉन्स आसंजन और अक्षतंतु विकास पर विभिन्न प्रभावों था, और subpopulation astrocytes दोनों न्यूरॉन आसंजन और अक्षतंतु विकास के लिए मजबूत निषेध दिखाया. Astrocyte अक्षतंतु और विकास के बीच बातचीत के अलावा, माइलिन गठन जैसे अन्य अध्ययनों पर इस विधि में इस्तेमाल किया जा सकता है, आंतरिक अक्षतंतु विकास क्षमता, जीन और संकेत में neuronal विकास परिवर्तन अक्षतंतु विकास से संबंधित रास्ते. यह भी चूहों और अन्य जानवरों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन FMMU नई नींव और आंशिक रूप से एनआईएच धन खोजने के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
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