Summary
Neste protocolo, descrevemos um novo método para estudar a influência da heterogeneidade das células gliais no crescimento do axônio com uma
Abstract
No sistema nervoso central de todos os mamíferos, os axônios cortados após a lesão não são capazes de regenerar as suas metas originais e recuperação funcional é muito pobre 1. O fracasso do axônio regeneração é um resultado combinado de vários fatores, incluindo o ambiente hostil de células gliais, as moléculas inibidoras de mielina relacionadas e diminuição da capacidade de regeneração intrínseca neurônio 2. Astrócitos são o tipo de célula glial predominante no sistema nervoso central e desempenham papel importante nas funções do axônio em fisiologia e patologia condições 3. Contraste com os oligodendrócitos homólogos, os astrócitos são uma população heterogênea de células compostas por diferentes subpopulações de astrócitos com morfologias diferentes e expressão do gene 4. O significado funcional dessa heterogeneidade, tais como suas influências sobre o crescimento do axônio, é largamente desconhecida.
Para o estudo da célula glial, especialmente a função da heterogeneidade de astrócitos no comportamento dos neurônios, foi estabelecido um novo método de co-cultura purificada de alta neurônios gânglios da raiz dorsal com células gliais obtidos a partir do córtex de ratos. Por esta técnica, nós fomos capazes de comparar diretamente adesão neurônio e crescimento do axônio em diferentes subpopulações astrócitos sob a mesma condição.
Neste relatório, nós damos o protocolo detalhada deste método para astrócitos isolamento e cultura, gânglios da raiz dorsal de isolamento e purificação neurônios, e os co-cultura de neurônios DRG com astrócitos. Este método também pode ser estendido para outras regiões do cérebro para estudar celular ou regionais específicos de interacção entre os neurônios e células gliais.
Protocol
1. Cultura de Células da glia
Células gliais podem ser cultivadas em diferentes regiões do sistema nervoso central. Todo o processo é mostrado na figura processo.
Dia 1 placa de cultura de revestimento e lamínulas
- Rodada microscópio seco esterilizado de vidro lamínulas em autoclave.
- Placa as lamelas esterilizados em placa de cultura esterilizado de 24 poços.
- Brasão as lamelas com poli-lisina e incubar por 2 horas sob temperatura de raiz.
- Revestir as placas de 6 bem a cultura da mesma maneira como no passo 3.
- Lavar as lamelas e 6 bem-placa de cultura duas vezes com água destilada e ar seco no capô cultura.
- Adicionar 200 mL meio DMEM (com FBS 10%) em cada poço em 24 poços da placa e 2 mL em cada poço em 6 bem-prato e colocá-los em incubadoras com menos de 37 graus com 5% de CO 2
Córtex dia 2 de isolamento e cultura de células gliais
- Esterilizar o capô dissecção positiva de fluxo.
- Ligue a luz UV por 20 min.
- Spray de todas as superfícies com álcool 70% e esperar 15 min antes do uso.
- mudança tensa: filhotes de ratos Anesthetize (P2-P6) por hipotermia, e decapitar na base do magnum framen usando uma tesoura operacional.
- Abrir o crânio ao longo da sutura sagital utilizando uma tesoura de íris e descolar do crânio.
- Remover o cérebro anterior e colocá-los em meio L15 refrigerados, sob estereomicroscópio, limpar cuidadosamente a membrana dura-máter e pia com os vasos sanguíneos, isolar o córtex e lave várias vezes com L15 médio.
- Corte o córtex em pedaços pequenos com tesoura de microcirurgia.
- Adicionar 0,125% de tripsina-EDTA preparado com L15 médio em pedaços córtex e incubar em 37 graus por 15 min.
- Transferência de blocos de tecido em meio DMEM 20mL com FBS 20% em 50 mL do tubo, adicione DNase solução estoque para 10ug/mL concentração final, aspire a solução tecido cima e para baixo por 20 vezes com fogo de vidro polido Pasteure pipeta, recolher a suspensão de células individuais.
- Lavar a suspensão de células com um tempo médio DMEM, re-suspender as células em DMEM com 10% de FBS, a contagem de células ao microscópio com um hemocitômetro células, semente de 5000-10000/cm 2. Manter as células em uma incubadora de 37 graus de 5%, mudança de metade do meio 2 vezes por semana.
2. Dorsal Root Gânglios Neurônios Isolamento, Cultura e Purificação
Dia 1 Prepare Cultura Material
- Revestimento do lamínulas esterilizadas com poli-lisina lamínulas, lave duas vezes com destilar a água eo ar seco, colocá-los em placas de 24 poços.
- Adicionar médio Neurobasal 100μL com 2% B27 e NGF 2.5s (50 ng / mL), colocar placa em 37 graus 5% CO 2.
Dia 2 Isolate DRGs a partir de embriões
- Esterilizados a capela de fluxo do mesmo modo como a cultura de células gliais.
- Euthanize um rato grávidas (E15) por overdose com CO 2, abdômen esterilizados por etanol 70%, os embriões foram isolados do útero e colocado em meio L15 refrigerados.
- Isolar cabos Espinhal com gânglios da raiz dorsal conectada sob estereomicroscópio e transferência para pratos de 35mm com média L15 refrigerados.
- Coletar suspensão única célula e lave uma vez com NBF médio (médio Neurobasal contendo 2% B27 e 2.5s NGF (50 ng / mL)).
Dia 3 Purify neurônios DRG
- 18h-24h após a semeadura neurônio, adicionar uma solução de 1 mM de ações concentradas FUDR à cultura neurônio para uma concentração final de 20 mM e um volume final de 200 mL.
- 72h depois, substituir a metade da média com o meio Neurobasal contendo 2% B27 e 2.5s NGF (50ng/mL) sem FUDR. Depois disso, mude o meio de todos os outros dias.
3. Co-cultura de neurônios DRG com células gliais
- Quando a cultura de células gliais chegou confluência (cerca de 20 dias após a semeadura), eles estavam prontos para co-cultura com os neurônios.
- 24 horas antes de adicionar os neurônios purificada, médio células gliais foram alteradas para médio Neurobasal contendo 2% B27 e 2.5s NGF (50 ng / mL).
- Neurônios purificada foram coletados de poços cultura, a suspensão de células individuais foram obtidos pela passagem mecânica através do fogo pipeta Pasteure polido.
- Após contagem do número, os neurônios foram semeadas em 500/cm 2 em células gliais confluentes em meio contendo 2% Neurobasal B27 e 2.5s NGF (50ng/mL).
- Neurônios de adesão e crescimento neuritos em células gliais poderiam ser registrados e analisados em momentos diferentes por um software de análise de imagem e imunocitoquímica utilizando anticorpos tipo específico de célula.
4. Resultados representante
- Cultura de células gliais: Após a semeadura, as células gliais se tornará confluentes em torno de 20 dias. Microsc sob contraste de faseope, foi facilmente identificado que as diferentes subpopulações de células gliais morfológica formada subestruturas padrão diferente de crescimento e os astrócitos GFAP positivos representaram mais de 90% como mostrado pela técnica immuocytochemisty (Figura 1, Figura 2).
- DRG cultura neurônios: Em nosso método, após 72 horas de tratamento FUDR, a pureza de neurônios DRG vai chegar tão alto quanto 99% dentro de seis dias, os neurônios DRG mostraram a sua morfologia única e com um crescimento de alta densidade neurite (Figura 3, Figura 4).
- Co-cultura de células gliais e neurônios: os neurônios DRG adesão e crescimento de neuritos ocorreu prontamente em células da glia dentro de 4 horas após a semeadura, observações cuidadosas mostraram que a adesão neurônio e crescimento neurite foram influenciados por subpopulações de células da glia que formavam subestruturas padrão especial de crescimento, isso poderia ser facilmente identificados sob microscópio com contraste de fase e por imunocitoquímica (Figura 5, Figura 6).
Figura 1. Morfologia de células gliais confluentes. Cortical células gliais foram semeadas em lamínulas revestido polilisina e cultivadas por 20 dias, observe o padrão de crescimento diferentes de células gliais, as células do lado esquerdo e dispostos de forma radiada.
Figura 2. Confluentes células gliais rotulado por Glial ácidas anticorpo proteína fibrilar (GFAP). Note o arranjo radiado de GFAP (vermelho) células positivas no lado direito.
Figura 3. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal cresceu in vitro sem tratamento FUDR. As células contaminantes formados DRG fundo neurônios.
Figura 4. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal cresceu in vitro após tratamento FUDR. As células de fundo contaminação havia sido eliminada completamente.
Figura 5. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal cultivadas em células gliais. Neurônios adesão e crescimento neurite foram inibidos nas células irradiadas organizado e limitado sobre as células gliais lado direito.
Figura 6. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal que crescem em células gliais marcados por anticorpos neurofilamento. A neurite (verde) foram inibidos na irradiada dispostos células gliais lado esquerdo e limitado no lado direito, todas as células gliais foram marcados por GFAP anticorpo (vermelho).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo experimento foi projetado para atingir dois objetivos de estudar as células da glia, astrócitos influência heterogeneidade especialmente sobre neurônio adesão e crescimento neurite. O primeiro objetivo era manter a heterogeneidade astrócitos, tanto quanto possível, neste experimento, a célula glial confluentes astrócitos cultura enriquecida foi misturado cultura primária, sem qualquer tratamento químico e propagação de digestão, o que pode prejudicar ainda mais a célula e induzir a resposta a uma lesão de astrócitos. A pureza final astrócitos é mais do que 90% GFAP positivas, com fibroblastos de contaminação inferior a 1%, como verificado por fibrobasts FN. A densidade de semeadura de baixa no início células fez passar por várias rodadas de divisão antes da confluência. Em microscópio de contraste de fase, a heterogeneidade das células gliais foi observada pela subestrutura diferentes formado por diferentes astrócitos morfológica. O segundo objetivo era fazer com que os neurônios DRG alta purificado e co-cultura-los com células gliais para estudar a influência heterogeneidade no comportamento do neurônio. Contaminando as células nos gânglios da raiz dorsal, como fibroblastos e células de Schwann aparentemente poderia influenciar ou alterar o crescimento do axônio em condições de cultura 5, 6, para evitar essa influência indesejada, os neurônios DRG foram cultivadas em meio livre de soro e tratadas por FUDR por 72h para matar todos os os outros tipos de células. Após esse tratamento, os neurônios DRG pode ser purificado tão alto quanto 99%. Foi mais eficiente do que o método tradicional, que precisa tratar a cultura de neurônios várias vezes sete. Aderência único neurônio DRG e crescimento do axônio podem ser facilmente monitorados e controlados sob o microscópio de contraste de fase, gravando lapso de tempo e método de análise de imagem, sua interação com as células da glia pode ser analisada em detalhes por imunocitoquímica e técnica de microscopia eletrônica.
Foi observado que os neurônios DRG não poderia ser mantida in vitro por mais de quatro semanas, a sua sobrevivência não tinha nenhum sinal de redução, mas eles não podiam aderir ao substrato por mais tempo, geralmente eles iriam retirar and roll up.
Neurônios DRG poderia ser mantida em células astroglial por um longo tempo (mais de 2 meses). Esta co-cultura de longo prazo entre os neurônios DRG alta purificado e astrócitos fazer o rastreamento de neurônios individuais e crescimento do axônio em diferentes tipos de astrócitos com mais facilidade, mas também evitar a influência descontrolada de células outras contaminações em gânglios da raiz dorsal. Durante o processo de cultura geral, todas as células devem ser manuseados com cuidado e todas as células devem ser sempre imerso em meio de cultura. Para obter neurônios DRG de alta pureza, um ponto crítico é a duração do tratamento FUDR, mais de 72h tratamento irá comprometer significativamente a viabilidade celular e tratamento curto espaço de tempo podem não matar todas as células contaminação. Na condição ideal, podemos obter grande quantidade de neurônios DRG alta pureza dentro de 1 semana. Usando este sistema de co-cultura, descobrimos que, em contraste com crenças comuns, os astrócitos heterogêneos tinha influências diferentes sobre os neurônios de adesão e crescimento do axônio, e astrócitos subpopulação mostrou forte inibição para ambos adesão neurônio e crescimento do axônio. Além da interação entre astrócitos e crescimento do axônio, este método poderia ser usado em outros estudos sobre como a formação de mielina, alterações de desenvolvimento neuronal na capacidade intrínseca axônio crescimento, genes e caminhos de sinal relacionado com o crescimento do axônio. Também pode ser usada em camundongos e outros animais centrais "regiões do sistema nervoso para estudar a interação entre neurônios e células gliais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por FMMU nova descoberta fundação e financiando parte do NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
