Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 함께 축삭의 성장에 glial 세포 이질의 영향을 연구하는 새로운 방법을 설명
Abstract
모든 포유 동물의 중추 신경계에 부상 후 절단 axons 1 매우 가난 원래의 목표와 기능 회복에 재생 수 없습니다. 축삭 재생의 실패는 적대적 glial 세포 환경 억제 myelin 관련 분자 및 내장 신경 세포 재생 능력이 감소 등 여러 가지 요인의 복합 결과입니다. Astrocytes는 중추 신경계에서 가장 지배 glial 세포 유형이며, 생리학 및 병리 조건 3 아래의 축삭 기능에 중요한 역할을한다. 동종 oligodendrocytes에 대비, astrocytes는 다양한 morphologies 및 유전자 발현 4 가지 astrocyte subpopulations로 구성된 이종 세포 인구입니다. 같은 축삭의 성장에 대한 자신의 영향으로이 이질의 기능적 의미는, 대부분 알 수 있습니다.
특히 glial 세포, 신경 세포의 동작 astrocyte 이질의 기능을 연구하기 위해, 우리는 쥐의 피질에서 얻은 glial 세포와 공동 culturing 높은 정화 등의 루트 신경의 신경에 의해 새로운 방법을 만들었습니다. 이 기법으로, 우리는 직접적으로 동일한 조건하에 다른 astrocytes의 subpopulations에서 신경 세포의 부착 및 축삭의 성장을 비교할 수 있었다.
이 보고서에서 우리는 astrocytes 절연 및 문화 등의 루트 신경 뉴런의 절연 및 정화하고, astrocytes와 뉴런을 DRG의 공동 문화에 대해이 방법의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 뉴런과 glial 세포 사이의 세포 또는 지역 특정 상호 작용을 연구하는 다른 뇌 영역 확장 수 있습니다.
Protocol
1. Glia 세포 문화
Glial 세포는 중추 신경계의 다른 지역에서 교양 수 있습니다. 전체 프로세스는 프로세스 그림에 표시됩니다.
1 일 코팅 문화 플레이트와 coverslips
- 건조 멸균 유리 현미경의 원형은 압력솥에 coverslips.
- 멸균 24 웰 플레이트에 문화 플레이트 살균 coverslips.
- 코팅 폴리 - 라이신과 루트 온도에 따라 2 시간 동안 부화와 coverslips.
- 3 단계와 같은 방식으로 코트 6 - 웰 문화 번호판입니다.
- 증류수와 문화 후드의 건조 공기를 두 번 coverslips 6 - 글쎄 문화 플레이트 씻으십시오.
- 5 % CO 2와 37 정도에 따라 6 자 판 24 - 잘 판 각 잘 2 ML 각 물론 200 μL DMEM 매체를 (10 % FBS)를 추가하고 인큐베이터에 넣어
2 일 분리 피질과 glial 세포 배양
- 긍정적인 흐름 절개 후드를 소독.
- 20 분 대한 자외선을 켭니다.
- 70 % 에탄올 모든 표면을 스프레이하고 사용하기 전에 15 분 기다립니다.
- 시제 변화 : 마취 쥐 저체온증에 의해 새끼 (P2 - P6), 및 운영 가위를 사용하여 framen 매그넘의 기지에서 목을 베다.
- 두개골에서 이리스 가위와 껍질을 사용하여 화살 봉합 따라 두개골을 엽니다.
- forebrain를 제거하고 stereomicroscope에서 차게 L15 중간 넣어, 신중하게, 혈관과 함께 두라와 피아 멤브레인을 청소 피질을 분리하고 L15 매체를 여러 번 씻는다.
- 미세의 가위와 작은 조각으로 피질 컷.
- 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 15 분 37 급 피질의 조각과 부화에 L15 매체를 사용한 0.125 %를 추가합니다.
- 최종 농도 10ug/mL에 DNase 주식 솔루션을 추가 조직 솔루션을 대기음 아래 화재 광택 유리 Pasteure 피펫 20 번, 단일 세포 현탁액을 수집, 50mL 튜브에 최고 20 % FBS와 20mL DMEM 매체로 조직 블록을 전송합니다.
- DMEM 매체를 다시 중지 10% FBS과 DMEM의 세포를 5000-10000/cm 2 hemocytometer, 씨앗 세포와 현미경으로 세포를 계산합니다.와 세포 현탁액 한 번 씻으십시오 37 학위 5% 배양기에서 세포를 유지, 주당 2 회 매체의 절반을 변경합니다.
2. 도설 루트 신경 뉴런의 절연, 문화 및 정제
1 일 문화의 자료를 준비
- 폴리 - 라이신, 세차 coverslips와 살균 coverslips 두 번과 물과 공기 건조를 증류 코트는 24 잘 접시에 넣어 두었어요.
- 2퍼센트 B27와 2.5S NGF (50 NG / ML)로 100μL Neurobasal 매체를 추가, 37도 5 % CO 2에 접시를 넣어.
일 2 배아에서 DRGs을 분리
- glial 세포 배양과 같은 방법으로 흐름 후드를 소독.
- CO 2, 70 % 에탄올로 소독 복부와 과다 복용하여 임신 쥐 (E15)를 안락사, 배아는 자궁에서 분리 차게 L15 중간에 투입되었다.
- 냉장 L15 매체와 35mm 요리 stereomicroscope 및 전송 아래에 연결 등의 루트 신경로 척수 코드를 분리.
- 단일 세포 현탁액를 수집하고 NBF 매체 (Neurobasal 매체 2% B27와 2.5S NGF (50 NG / ML) 포함)을 한 번 씻는다.
3 일 정화 DRG 뉴런에게
- 18H - 24 신경 세포의 시딩 후, 20 μm의 200 μL의 최종 볼륨의 최종 농도에 신경 세포의 문화에 1 ㎜ 집중 FUDR 주식 솔루션을 추가합니다.
- 72h는 나중에, FUDR없이 2퍼센트 B27와 2.5S NGF (50ng/mL)이있는 Neurobasal 매체로 절반 매체를 교체하십시오. 그 후, 매일 매체를 변경합니다.
3. glial 세포와 Coculture DRG 뉴런
- glial 세포 배양이 합류를 (시딩 이후 20 일 정도)에 도달하면, 그들은 뉴런과 coculture 준비했다.
- 24시간 정화 뉴런을 추가하기 전에, glial 세포 매체는 2퍼센트 B27와 2.5S NGF (50 NG / ML)이있는 Neurobasal 매체로 변경되었습니다.
- 정화 뉴런이 문화 우물에서 수집된 단일 세포 현탁액은 화재 광택 Pasteure의 피펫을 통해 기계적 전달하여 얻은되었습니다.
- 숫자를 계산하면, 뉴런은 2퍼센트 B27와 2.5S NGF (50ng/mL)이있는 Neurobasal 매체 합류 glial 세포에서 500/cm 2 씨앗을 품고 있었다.
- glial 세포에서 뉴런의 부착 및 neurite 성장이 기록과 세포 유형의 특정 항체를 사용하여 이미지 분석 소프트웨어와 immunocytochemistry에 의해 서로 다른 시간 시점에서 분석할 수 있습니다.
4. 대표 결과
- Glial 세포 배양이 : 시딩 후, glial 세포는 20 일 정도 합류하게 될 것입니다. 위상 콘트라스트 microsc에서ope, 그것은 쉽게 다른 형태학의 glial 세포 subpopulations 다른 성장 패턴 substructures를 결성하고 immuocytochemisty 기술 (그림 1, 그림 2) 그림과 같이 GFAP 긍정적인 astrocytes가 90 % 이상 차지하는 것이 확인되었다.
- DRG 뉴런의 문화 : 우리의 방법에서 72 시간 FUDR 치료 후, DRG 뉴런의 순도 6 일 이내 99%만큼 높이 도달할 것이며, DRG 뉴런들은 독특한 morphologies을 보여주 높은 밀도 neurite 성장 (그림 3, 그림 4).
- Glial 세포와 뉴런 coculture : DRG 뉴런의 부착 및 neurite의 파생물이 시딩 후 4 시간 이내 glial 세포에서 쉽게 발생,주의 관찰이 신경 세포의 부착 및 neurite 성장이 특별한 성장 패턴 substructures을 형성 glial 세포 subpopulations에 의해 영향을 것을 보여주었다, 이것은 쉽게 확인 수 위상 콘트라스트 현미경과 immunocytochemistry (그림 5, 그림 6)에서.
그림 1. 합류 glial 세포의 형태가. 두피 glial 세포가 polylysine 코팅 coverslip에 도금 20 일 동안 교양 있었다, glial 세포의 서로 다른 성장 패턴을 참고, 왼쪽에있는 세포는 방사 방법으로 배열.
그림 2. Glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 항체에 의해 표시 콘플루앙 glial 세포가. 오른쪽에 GFAP (적색) 긍정적인 세포의 방사 배열을 확인합니다.
그림 3. 도설 루트 신경의 뉴런은 FUDR 치료하지 않고 체외에서 성장했다. 훼손 세포가 뉴런 '배경을 DRG 형성.
그림 4. 도설 루트 신경의 뉴런은 FUDR 치료 후 체외에서 성장했다. 배경 오염 세포가 완전히 제거했다.
그림 5. glial 세포에서 성장 도설 루트 신경의 뉴런은. 뉴런의 부착 및 neurite 성장은 방사 배열 세포에 저해과 오른쪽 glial 세포에 국한되었다.
그림 6. neurofilament 항체에 의해 분류 glial 세포에서 성장 도설 루트 신경의 신경이. neurite (녹색)가 방사 배열 왼쪽 glial 세포에서 저해하고 오른쪽에 제한되었다, 모든 glial 세포는 GFAP 항체 (적색)으로 표시했다.
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Discussion
이 실험 프로토콜은 glial 세포, 신경 세포의 부착 및 neurite 성장에 특히 astrocyte 이질의 영향을 연구하는 두 목표를 달성하도록 설계되었습니다. 첫 번째 목표는이 실험에서 astrocyte 이질 최대한을 유지하는 것이었다, 합류 glial 세포 배양 농축 astrocytes는 더욱 세포를 손상 astrocytes의 부상 반응을 유발 수있는 화학 치료 및 소화 전파없이 기본 문화를 혼합했다. 최종 astrocyte 순도가 fibrobasts FN 의해 검증으로 1 % 미만 오염 섬유아 세포와 90 % 이상 GFAP 양성입니다. 처음 만들어진 세포에서 낮은 시딩 밀도는 합류하기 전에 부서의 여러 순찰을 받고있다. 위상 콘트라스트 현미경, glial 세포 이질이 다른 형태학의 astrocytes에 의해 형성된 여러 가지 기초 공사에 의해 관찰되었다. 두 번째 목표는 높은 정화 DRG의 뉴런을하는 것이었과 뉴런의 행동에 이질의 영향을 연구 glial 세포와 그들을 coculture. 이러한 섬유아 세포 및 schwann 세포와 같은 지느러미 루트 신경의 오염 세포가 분명히이 원치 않는 영향을 피하기 위해, 문화 조건 5, 6에서 축삭의 성장에 영향을 미칠하거나 변경 수 DRG 뉴런은 혈청 무료 매체 교양 모든 죽일 72h에 대한 FUDR에 의해 치료되었다 다른 세포 유형. 이 치료 후, DRG 뉴런 99 %로 높이 정화 수 있습니다. 이것은 뉴런의 문화를 여러 번 7 치료를 필요로 전통적인 방법보다 더 효율적했다. 단일 DRG의 신경 세포의 부착 및 축삭의 성장이 쉽게 모니터링하고 시간 경과 기록 및 영상 분석 방법으로 위상 콘트라스트 현미경으로 추적할 수, glial 세포와의 상호 작용은 immunocytochemistry과 전자 현미경 기술에 의해 세부 분석 수 있습니다.
그것은 DRG 뉴런이 4 개 이상의 주 체외에서 유지되지 않을 수 있다고 지적했다, 그들의 생존은 감소의 흔적은 없었다 그러나 그들은 더 이상 기판을 준수하지 못했습니다, 보통 그들은 분리 최대 롤 것이다.
DRG의 뉴런은 오랫동안 astroglial 전지 (2 개 이상 개월)에 유지 수 있습니다. 높은 정화 DRG의 뉴런과 astrocytes 사이 장기 coculture보다 쉽게 astrocytes의 다른 유형에 하나의 뉴런과 축삭 성장의 추적을, 또한 지느러미 루트 신경에있는 다른 오염 세포의 통제 영향을 피할 수 있습니다. 전체 문화 과정 동안, 모든 세포는 신중하게 다루어 져야 모든 세포는 항상 문화 매체에 열중한다. 고순도 DRG의 신경을 얻으려면, 중요한 포인트는 FUDR 치료의 기간이며, 72h 이상의 치료는 크게 모든 오염의 세포를 죽일 수 없습니다 세포 생존과 짧은 시간 치료를 손상됩니다. 최적의 조건에서, 우리는 1 주일 이내에 고순도의 DRG 뉴런의 다량을 얻을 수 있습니다. 이 coculture 시스템을 사용하여, 우리는 일반적 믿음과는 달리, 이기종 astrocytes은 뉴런의 부착 및 축삭의 성장에 다른 영향도 가지고 것을 발견하고, subpopulation의 astrocytes은 신경 세포의 부착 및 축삭의 성장 모두에 강력한 억제를 보여줬어요. astrocyte와 축삭의 성장 사이의 상호 작용 이외에,이 방법은 같은 myelin 형성 다른 연구에 사용할 수 내장 축삭의 성장 능력, 유전자 신호에의 연결을 개발 변경 사항은 축삭의 성장에 관련된 경로. 이것은 마우스와 뉴런과 glial 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 다른 동물의 중추 신경계 지역에서도 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 FMMU 새로운 재단과 부분적으로 NIH의 기금을 찾는 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
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