Summary
Bu protokol, glial hücre heterojenite bir akson büyüme üzerindeki etkisini incelemek için yeni bir yöntem tarif
Abstract
Tüm memelilerin merkezi sinir sisteminde, yaralanma sonrası kopmuş aksonları 1 çok kötü orijinal hedefleri ve fonksiyonel iyileşme, rejenerasyon mümkün değildir. Akson rejenerasyonu yetmezliği kombine düşmanca glial hücre çevre, miyelin ilgili inhibitör molekülleri ve içsel nöron rejeneratif kapasitesi 2 azalma da dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin bir sonucudur. Astrositler merkezi sinir sisteminde en baskın glial hücre tipi ve fizyoloji ve patoloji koşulları 3 altında akson fonksiyonlarında önemli rol oynar. Kontrast, homolog oligodendrosit astrositler farklı morfolojileri ve gen ekspresyonu 4 farklı astrosit alt popülasyonlar oluşan heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Akson büyüme üzerindeki etkiler bu heterojenite fonksiyonel önemi, büyük ölçüde bilinmemektedir.
Özellikle glial hücre, nöron davranış astrosit heterojenite fonksiyonunu incelemek için, biz, ortak kültür, sıçan korteks elde glial hücreleri ile yüksek saflaştırılmış dorsal kök gangliyon nöronları yeni bir yöntem oluşturdu. Bu teknikle, aynı koşul altında farklı astrositler alt popülasyonlar nöron yapışma ve akson büyüme karşılaştırabileceksiniz.
Bu raporda, astrositler izolasyonu ve kültürü, dorsal kök ganglionlar nöronlar izolasyon ve saflaştırma ve astrositler ile nöronların DRG ko-kültür için bu yöntemi ayrıntılı protokol verir. Bu yöntem ayrıca, nöronlar ve glial hücreler arasındaki hücresel veya bölgesel belirli bir etkileşim çalışması için diğer beyin bölgelerine uzatılabilir.
Protocol
1. Glia Hücre Kültür
Glial hücreleri, merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinde yetiştirilebilir. Tüm süreç süreç resimde gösterilmiştir.
Gün 1 Kaplama kültür plaka ve lamelleri
- Kuru steril cam mikroskop yuvarlak bir otoklavda lamelleri.
- Sterilize 24-kuyu kültür plaka içine Plaka sterilize lamelleri.
- Kat poli-lisin ve kök sıcaklık altında 2 saat süreyle inkübe lamelleri.
- 3. adımı aynı şekilde Kat 6 kuyu kültür plakalar.
- Lamelleri ve 6-iyi bir kültür plaka iki kez distile su ve kültür kaputun içindeki kuru hava ile yıkayın.
- 37 derece altında,% 5 CO 2 ile 6-plaka 24-plaka ve 2 mL her bir kuyu içinde her bir kuyunun 200 mcL DMEM orta (% 10 FBS) ekleyin ve kuvöz içine koydu
2. Gün Yalıtımlı korteks ve glial hücre kültürü
- Pozitif akış diseksiyonu kaput sterilize edin.
- 20 dakika UV ışığı açın.
- % 70 etanol ile tüm yüzeylerde Sprey ve kullanmadan önce 15 dakika bekleyin.
- gergin değiştirmek: anestezisi sıçan hipotermi yavrular (P2-P6) ve işletim makas kullanarak framen magnum üssünde başını kesmek.
- Kafatası kapalı bir iris makas ve soyma kullanarak sagital sütür boyunca kafatası açın.
- Önbeyin çıkarın ve stereomikroskop altında, L15, orta soğutulmuş içine koymak, dikkatli bir şekilde, kan damarları ile dura ve pia membran temiz korteks izole ve L15 orta birkaç kez yıkayın.
- Korteks mikrocerrahi makas ile küçük parçalar halinde kesin.
- Tripsin-EDTA için 37 derece 15 dakika, korteks parçaları ve inkübe içine orta L15 ile hazırlanan% 0.125 ekleyin.
- Final konsantrasyon 10ug/mL DNaz stok solüsyonu eklemek için, doku çözüm aspirat ve yangın parlatılmış cam Pasteure pipet ile 20 kez, tek hücre süspansiyon toplamak, tüp içinde 50ml 20ml DMEM ortama% 20 FBS ile doku blokları transfer.
- DMEM orta, yeniden askıya% 10 FBS ile DMEM hücreleri, 5000-10000/cm 2 hemasitometre, tohum hücreleri ile mikroskop altında hücreleri saymak. Hücre süspansiyonu bir kez yıkayın . 37 derece% 5 inkübatör hücreleri koruyun, orta haftada 2 kez yarım değiştirin.
2. Dorsal kök gangliyon Nöronlar İzolasyon, Kültür ve Arıtma
1. Gün Kültür Malzeme hazırlayın
- Poli-lizin, yıkama lamelleri ile sterilize lamelleri ile iki kez su ve hava kuru damıtmak Coat, 24 kuyu tabak içine koydu.
- % 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50 ng / ml) ile 100μL Neurobasal orta, 37 derece,% 5 CO 2 tabak koyun.
2. Gün embriyolar DRG'ler Isolate
- Glial hücre kültürü aynı şekilde akışını kaput sterilize edilmiştir.
- Doz aşımı ile CO 2,% 70 etanol ile sterilize karın hamile bir sıçan Euthanize (E15), embriyolar rahim izole edilmiş ve soğutulmuş L15 orta koymak.
- 35mm yemekleri stereomikroskopta ve transfer altında soğutulmuş L15 orta dorsal kök gangliyon Spinal kabloları izole edin.
- Tek hücre süspansiyonu toplayın ve NBF orta (Neurobasal orta% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50 ng / ml) içeren) ile bir kez yıkayın.
3. Gün Purify DRG Nöronlar
- 18h-24h nöron tohumlama sonra, nihai konsantrasyonu 20 mcM ve son hacim 200 mcL nöron kültürüne 1 mM konsantre FUDR stok solüsyonu ekleyin.
- 72h sonra Neurobasal orta FUDR olmadan% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50ng/mL) içeren yarım orta yerine. Bundan sonra, her gün orta değiştirin.
3. Glial hücreleri ile Coculture DRG nöronlar
- Glial hücre kültürü izdiham (20 gün sonra tohumlama) ulaştığında, bu nöronlar ile coculture hazır.
- 24 saat arıtılmış nöronlar eklemeden önce, glial hücreler orta,% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50 ng / ml) içeren Neurobasal orta değiştirildi.
- Saf nöronlar kültür kuyulardan toplanmıştır yangın cilalı Pasteure pipet ile mekanik geçerek, tek hücre süspansiyonu elde edildi.
- Nöron sayısını sayma sonra,% 2 B27 ve 2.5 sn NGF (50ng/mL) içeren Neurobasal orta konfluent glial hücreler üzerinde 500/cm 2 numaralı seribaşı.
- Glial hücreler nöronlar yapışma ve neurite büyüme kaydedilmiş ve hücre tipi özel antikorları kullanarak görüntü analiz yazılımı ve immünhistokimya farklı zaman noktalarında analiz olabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
- Glial hücre kültürü: tohumlama sonra, glial hücreleri yaklaşık 20 günde konfluent olacak. Faz kontrast microsc altındayerdir, kolayca farklı morfolojik glial hücre alt farklı büyüme paterni altyapılar oluşturdu ve immuocytochemisty tekniği (Şekil 1, Şekil 2) gösterildiği gibi GFAP pozitif astrositler% 90 daha fazla olduğu tespit edilmiştir.
- DRG nöronlar kültürü: yöntem, 72 saat FUDR tedavi sonra, DRG nöronların saflık 6 gün içinde% 99 gibi yüksek ulaşacak, DRG nöronlar kendi benzersiz morfolojileri gösterdi ve yüksek yoğunluklu neurite büyüme (Şekil 3, Şekil 4).
- Glial hücre ve nöronlar coculture: DRG nöronlar yapışma ve neurite akıbet tohumlama sonra 4 saat içinde glial hücreleri kolayca oluştu, dikkatli gözlemler nöron yapışma ve neurite büyüme özel büyüme paterni altyapılardan oluşan glial hücre alt etkilenmiş olduğunu gösterdi, bu kolayca tespit edilebilir faz kontrast mikroskop altında ve immünsitokimya (Şekil 5, Şekil 6).
Şekil 1. Konfluent glial hücrelerin morfolojisi. Kortikal glial hücreleri polylysine kaplı lamel kaplama ve 20 gün kültüre, glial hücreler farklı büyüme paterni not, sol tarafındaki hücreleri yayılan bir şekilde düzenlenmiştir.
Şekil 2. Glial fibriler asidik protein (GFAP) antikor etiketli konfluent glial hücreleri sağ tarafta GFAP (kırmızı) pozitif hücrelerin yayılan düzenleme unutmayın.
Şekil 3. Dorsal kök gangliyon nöronları FUDR tedavi olmadan in vitro büyüdü. Kirlenmesine neden olan hücreleri nöronların background DRG kurdu.
Şekil 4. Dorsal kök gangliyon nöronları FUDR tedavi sonra in vitro büyüdü. Arka plan kirlenmesine neden olan hücreler tamamen ortadan kaldırılmıştır.
Şekil 5. Glial hücreler üzerinde yetişen Dorsal kök gangliyon nöronları. Nöronlar yapışma ve yayılan düzenlenmiş hücreleri inhibe neurite büyüme ve sağ tarafında glial hücreler üzerinde sınırlı kalmıştır.
Şekil 6. Nörofilaman antikor etiketli glial hücreler üzerinde büyüyen Dorsal kök gangliyon nöronları neurite (yeşil), yayılan sol tarafında düzenlenen glial hücreleri inhibe ve sağ tarafında sınırlı idi, tüm glial hücreler GFAP antikor (kırmızı) etiketli .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deney protokolü, glial hücreler, nöron yapışma ve neurite büyüme özellikle astrosit heterojenite etkisi çalışma iki hedeflere ulaşmak için tasarlanmıştır. Ilk golü bu deneyde astrosit heterojenite, mümkün olduğu kadar korumak için, konfluent glial hücre kültürü zenginleştirilmiş astrositler daha fazla hücre hasarı ve astrositler yaralanması tepki neden olabilecek herhangi bir kimyasal tedavi ve sindirim yayılma olmadan birincil kültür karışık oldu. Son astrosit saflık fibrobasts FN tarafından doğrulanmadı olarak% 1'den daha az kontaminasyon fibroblastlar ile% 90 daha fazla GFAP pozitif. Bir başlangıç yaptı hücreleri düşük ekim yoğunluğu izdiham önce bölünme birkaç mermi uğrarlar. Faz kontrast mikroskop altında farklı morfolojik astrositler oluşturduğu farklı bir altyapı, glial hücre heterojenite gözlendi. Ikinci golü yüksek saflaştırılmış DRG nöronlar ve nöron davranışı üzerinde heterojenite etkisini incelemek için glial hücreleri ile coculture. DRG nöron hücreleri, fibroblastlar ve schwann hücrelerinden dorsal kök gangliyon kirletilmesi görünüşe göre bu istenmeyen etkilerini önlemek için, kültür koşullarında 5, 6 akson büyüme etkilemek veya değiştirmek olabilir, serum serbest orta kültürlü ve tüm öldürmek için 72h FUDR tarafından tedavi edildi diğer hücre türleri. Bu tedaviden sonra, DRG nöronların% 99 gibi yüksek temizlenmiş olabilir. Nöronların kültür birkaç kez 7 tedavisinde geleneksel yöntem daha verimli oldu. Tek DRG nöron yapışma ve akson büyüme kolaylıkla izlenir ve zaman atlamalı kayıt ve görüntü analiz yöntemi ile faz kontrast mikroskop altında izlenen, glial hücreleri ile etkileşimi immünsitokimya ve elektronik mikroskop tekniği ile ayrıntılı olarak analiz edilebilir.
DRG nöronlar in vitro fazla 4 hafta süreyle muhafaza olabilir not edildi, onların hayatta kalma azaltma hiçbir işaret yoktu ama artık substrat uygun olamazdı, genellikle ayırmak ve roll up.
DRG nöronlar Astroglial hücreleri (2 aydan fazla) uzun bir süre muhafaza edilebilir. Yüksek saflaştırılmış DRG nöronlar ve astrositler arasındaki bu uzun vadeli coculture, daha kolay astrositler farklı tip tek nöron ve akson büyüme takibi yapmak, aynı zamanda dorsal kök gangliyon diğer kontaminasyon hücrelerin kontrolsüz bir etkisi kaçının. Bütün kültür işlemi sırasında, tüm hücreleri dikkatli olmalı ve tüm hücrelerin kültür ortamında dalmış olmalıdır. Yüksek saflıkta DRG nöronlar almak için, kritik bir noktaya FUDR tedavi süresi, 72h tedavisi daha önemli hücresel canlılığı ve kısa sürede tedavi tüm kontaminasyon hücrelerini öldürmek değil uzlaşma olacak. En iyi durumda, biz 1 hafta içinde yüksek saflıkta DRG nöronların büyük miktarda elde edebilirsiniz. Bu coculture sistemi kullanarak, sık inançlara aksine, heterojen astrositler nöronlar yapışma ve akson büyüme üzerinde farklı etkilere sahip olduğunu buldu ve ICSI'nin astrositler, nöron yapışma ve akson büyüme için güçlü inhibisyonu gösterdi. Astrosit ve akson büyüme arasındaki etkileşimin yanı sıra, bu yöntem miyelin oluşumu gibi diğer çalışmalarda kullanılan olabilir, içsel akson büyüme kapasitesi, genler ve sinyal nöronal geliştirme değişiklikleri akson büyüme ile ilgili yolakları. Bu fareler ve nöronlar ve glial hücreler arasındaki etkileşimi incelemek için diğer hayvanların merkezi sinir sistemi bölgelerinde de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada, FMMU yeni bir temel ve kısmen NIH finansman bulma desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
