Summary
In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode om de invloed van de gliale cel heterogeniteit op axongroei studie met een
Abstract
In het centrale zenuwstelsel van alle zoogdieren, afgesneden axonen na verwonding niet in staat zijn te regenereren in hun oorspronkelijke doelen en functioneel herstel is zeer slecht 1. Het falen van regeneratie van axonen is een gecombineerde resultaat van verschillende factoren, waaronder de vijandige gliale cel omgeving, remmende myeline verwante moleculen en een verminderde intrinsieke neuron regeneratievermogen 2. Astrocyten zijn de meest overheersende gliale celtype in het centrale zenuwstelsel en spelen een belangrijke rol in het axon taken uit hoofde van fysiologie en pathologie voorwaarden 3. Tegenstelling tot de homologe oligodendrocyten, astrocyten zijn een heterogene celpopulatie samengesteld door verschillende astrocyten subpopulaties met verschillende morfologie en gen-expressie 4. De functionele betekenis van deze heterogeniteit, zoals hun invloeden op axon groei, is grotendeels onbekend.
De studie van de gliale cel, in het bijzonder de functie van astrocyte heterogeniteit in het gedrag van neuron, hebben we een nieuwe methode door de co-kweken van hoog gezuiverde achterwortelganglia neuronen met gliacellen verkregen uit de rat cortex. Door deze techniek konden we neuron hechting en axongroei direct vergelijken op verschillende subpopulaties astrocyten onder dezelfde voorwaarde.
In dit rapport geven we de gedetailleerde protocol van deze methode voor astrocyten isolatie en cultuur, achterwortelganglia neuronen isolatie en zuivering, en de co-cultuur van de DRG neuronen met astrocyten. Deze methode kan ook worden uitgebreid tot andere gebieden van de hersenen om de cellulaire of regionaal specifieke interactie tussen neuronen en gliacellen te bestuderen.
Protocol
1. Glia Cel Cultuur
Gliale cellen kunnen worden gekweekt uit verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel. Het hele proces is weergegeven in figuur proces.
Dag 1 Coating cultuur plaat en dekglaasjes
- Droog gesteriliseerd glas microscoop ronde dekglaasjes in een autoclaaf.
- Het bord van de gesteriliseerde dekglaasjes in gesteriliseerde 24-well plaat cultuur.
- Coat de dekglaasjes met poly-lysine en incubeer gedurende 2 uur onder wortel temperatuur.
- Coat 6-well platen cultuur op dezelfde manier als in stap 3.
- Twee keer was de dekglaasjes en 6-well cultuur plaat met gedestilleerd water en de lucht drogen in de cultuur kap.
- Voeg 200 pi DMEM medium (met 10% FBS) in elk putje in 24-well plaat en 2 ml in elk putje in 6-wells plaat en leg ze in de broedmachine onder 37 graden met 5% CO 2
Dag 2 isoleren cortex en gliale celculturen
- Steriliseer de positieve stroom dissectie kap.
- Schakel UV-licht gedurende 20 minuten.
- Spray alle oppervlakken met 70% ethanol en wacht 15 minuten voor gebruik.
- verandering tijd: Verdoof rat pups (P2-P6) door onderkoeling, en onthoofden aan de voet van het framen magnum met behulp van operationele schaar.
- Open de schedel langs de pijlnaad met behulp van een iris schaar en pel de schedel.
- Verwijder de voorhersenen en zet ze in gekoelde L15 medium, onder stereomicroscoop, zorgvuldig schoon de dura en de pia membraan met bloedvaten, isoleren van de cortex en was meerdere malen met L15 medium.
- Snijd de cortex in kleine stukjes met microchirurgie schaar.
- Voeg 0,125% trypsine-EDTA met L15 bereid medium in de cortex stukken en incubeer bij 37 graden gedurende 15 minuten.
- Overdracht weefsel blokken in 20 ml DMEM medium met 20% FBS in 50 ml tube, voeg DNase stockoplossing aan uiteindelijke concentratie 10ug/mL, het weefsel oplossing op aspireren en neer voor 20 keer met vuur gepolijst glas Pasteure pipet, het verzamelen van de individuele cellen ophanging.
- Was de celsuspensie een keer met DMEM-medium, opnieuw te schorten cellen in DMEM met 10% FBS, cellen te tellen onder de microscoop met een hemocytometer, zaad cellen in 5000-10000/cm 2. Behouden cellen in een 37 graden 5% incubator, veranderen de helft van het medium 2 keer per week.
2. Achterwortelganglia Neuronen Isolatie, Cultuur en zuivering
Dag 1 Maak Cultuur Materiaal
- De vacht van de gesteriliseerde dekglaasjes met poly-lysine, wassen coverslips tweemaal met gedistilleerd water en lucht drogen, zet ze in 24-well platen.
- Voeg 100μL Neurobasal medium met 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml), zet plaat in 37 graden 5% CO 2.
Dag 2 Isoleer DRG's uit embryo's
- Gesteriliseerd de stroming kap op dezelfde manier als gliale cel cultuur.
- Euthanaseren een zwangere rat (E15) door een overdosis met CO 2, gesteriliseerd buik met 70% ethanol, werd geïsoleerd uit embryo's baarmoeder en in gekoelde L15 medium.
- Isoleer ruggenmerg met de aangesloten achterwortelganglia onder stereomicroscoop en transfer naar 35mm gerechten met gekoelde L15 medium.
- Verzamel enkele celsuspensie en was een keer met NBF medium (Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml)).
Dag 3 Zuiver DRG neuronen
- 18u-24u na het neuron zaaien, voeg dan een een mM geconcentreerde FUDR stockoplossing aan het neuron cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM en een uiteindelijk volume van 200 pi.
- 72h later, vervang dan de helft van de medium met Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50ng/mL) zonder FUDR. Daarna, wijzigt u het medium om de andere dag.
3. Coculture DRG neuronen met gliacellen
- Wanneer gliale celcultuur samenloop (ongeveer 20 dagen na zaaien) bereikt, waren ze klaar voor coculture met neuronen.
- 24 uur voor het toevoegen van de gezuiverde neuronen, werden gliacellen medium veranderd in Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50 ng / ml).
- Gezuiverde neuronen werden verzameld van cultuur putten, waren enkele cellen ophanging verkregen door mechanische passeren vuur gepolijst Pasteure pipet.
- Na het tellen van het aantal, werden neuronen gezaaid op 500/cm 2 op confluent gliale cellen in Neurobasal medium dat 2% B27 en 2.5S NGF (50ng/mL).
- Neuronen hechting en neurieten groei op gliale cellen kunnen worden opgenomen en geanalyseerd op verschillende tijdstippen door beeldanalyse-software en met behulp van immunocytochemie celtype specifieke antilichamen.
4. Representatieve resultaten
- Gliale celculturen: Na het zaaien, zal gliacellen worden samenvloeiende ongeveer 20 dagen. Onder fase contrast MicroscOPE, was het gemakkelijk te herkennen dat verschillende morfologische gliale cel subpopulaties ander groeipatroon onderbouw gevormd en de GFAP positieve astrocyten goed voor meer dan 90% zoals blijkt uit immuocytochemisty techniek (figuur 1, figuur 2).
- DRG neuronen cultuur: In onze methode, na 72 uur FUDR behandeling, de zuiverheid van de DRG neuronen zal zo hoog als 99% te bereiken binnen 6 dagen, DRG neuronen toonden hun unieke morfologie en met een hoge dichtheid van neurieten groei (Figuur 3, Figuur 4).
- Gliale cellen en neuronen coculture: DRG neuronen hechting en neurietuitgroei zich gemakkelijk op de gliale cellen binnen de 4 uur na het uitzaaien, is een zorgvuldige observaties toonden aan dat neuron hechting en groei van neurieten werden beïnvloed door gliale cel subpopulaties die speciale groeipatroon onderbouw gevormd, kan dit gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd onder fasecontrastmicroscoop en door middel van immunocytochemie (Figuur 5, Figuur 6).
Figuur 1. Morfologie van confluerende gliacellen. Corticale gliale cellen werden uitgeplaat op polylysine gecoate dekglaasje en gekweekt gedurende 20 dagen, de verschillende groeipatroon van gliacellen nota, cellen aan de linkerkant gerangschikt in een uitgestraald manier.
Figuur 2. Confluente gliacellen gelabeld door gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) antilichaam. Let op de uitgestraalde opstelling van GFAP (rood) positieve cellen aan de rechterkant.
Figuur 3. Achterwortelganglia neuronen groeide in vitro zonder FUDR behandeling. Contaminerende cellen gevormd neuronen 'achtergrond DRG.
Figuur 4. Achterwortelganglia neuronen groeide in vitro na FUDR behandeling. De achtergrond contaminerende cellen was volledig geëlimineerd.
Figuur 5. Achterwortelganglia neuronen gekweekt op gliacellen. Neuronen hechting en neurieten groei werd geremd op de uitgestraalde geregeld cellen en beperkt aan de rechterkant gliacellen.
Figuur 6. Achterwortelganglia neuronen groeien op gliale cellen gelabeld door neurofilament antilichaam. De neurieten (groen) geremd op de uitgestraalde geregeld linkerkant gliacellen en beperkt aan de rechterkant, werden alle gliale cellen gelabeld door GFAP antilichaam (rood).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit experiment protocol is ontworpen om twee doelen te bereiken gliacellen, in het bijzonder astrocyten heterogeniteit van invloed op de neuron hechting en neurieten groei te bestuderen. Het eerste doel was om astrocyten heterogeniteit zoveel mogelijk, in dit experiment te houden, was de samenvloeiing gliale cel cultuur verrijkt astrocyten gemengde primaire cultuur zonder enige chemische behandeling en de spijsvertering voortplanting, die verder kan schade aan de cel en veroorzaken letsel reactie van astrocyten. De laatste astrocyten zuiverheid is meer dan 90% GFAP positief, met besmetting fibroblasten minder dan 1% als geverifieerd door fibrobasts FN. De lage dichtheid bij zaaien begin gemaakt cellen ondergaan verschillende rondes van de verdeling voor de samenloop. Onder fasecontrastmicroscoop, was de gliale cel heterogeniteit waargenomen door de verschillende onderbouw gevormd door verschillende morfologische astrocyten. Het tweede doel was om een hoog gezuiverd DRG neuronen te krijgen en coculture ze met gliacellen de heterogeniteit invloed op het neuron het gedrag te bestuderen. Contaminerende cellen in achterwortelganglia zoals fibroblasten en Schwann-cellen kon blijkbaar beïnvloeden of te veranderen de axon groei van de kweekomstandigheden 5, 6, om deze ongewenste invloed te vermijden, werden DRG neuronen gekweekt in serum vrij medium en behandeld door FUDR voor 72u aan alle doden de andere celtypes. Na deze behandeling, kan DRG neuronen worden gezuiverd zo hoog als 99%. Het was efficiënter dan traditionele methode die moet de behandeling van de neuronen cultuur een paar keer 7. Enkele DRG neuronen hechting en axongroei kan gemakkelijk worden gecontroleerd en gevolgd onder fase-contrast-microscoop door time lapse opname-en imaging analysemethode konden hun interactie met gliale cellen worden geanalyseerd in details door middel van immunocytochemie en elektronische microscoop techniek.
Er werd opgemerkt dat DRG neuronen niet kon worden gehandhaafd in vitro voor meer dan 4 weken, hun overleving geen teken van reductie hadden, maar zij konden niet houden aan de ondergrond nog langer, vaak zouden ze los en oprollen.
DRG neuronen kon worden gehandhaafd op astroglial cellen voor een lange tijd (meer dan 2 maanden). Deze lange termijn coculture tussen hoog gezuiverd DRG neuronen en astrocyten maken het volgen van enkele neuronen en axonen groei op verschillende soorten van astrocyten gemakkelijker, maar ook voorkomen dat de ongecontroleerde invloed van andere verontreinigingen cellen in achterwortelganglia. Gedurende het hele cultuur-proces, moeten alle cellen zorgvuldig behandeld en alle cellen moet altijd worden ondergedompeld in de cultuur medium. Om hoge zuiverheid DRG neuronen, een kritisch punt is de duur van de FUDR behandeling, zal meer dan 72 uur behandeling aanzienlijk compromis cellulaire levensvatbaarheid en de korte tijd behandeling kan niet doden alle vervuiling cellen. In de optimale conditie, kunnen we grote hoeveelheden met hoge zuiverheid DRG neuronen te krijgen binnen 1 week. Met behulp van dit systeem coculture, vonden we dat, in tegenstelling tot de algemeen overtuigingen, heterogene astrocyten verschillende invloeden gehad op neuronen hechting en axon groei, en subpopulatie astrocyten toonde een sterke remming van zowel neuron hechting en axon groei. Naast de interactie tussen astrocyt en axongroei, deze methode kan worden gebruikt in op andere studies, zoals myeline vorming, paden neuronale ontwikkeling veranderingen in de intrinsieke axon groeicapaciteit, genen en het signaal met betrekking tot axon groei. Het kan ook gebruikt worden in muizen en andere dieren 'van het centrale zenuwstelsel regio's om de interactie tussen neuronen en gliacellen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door FMMU nieuwe vinding fundering en gedeeltelijk NIH financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
