Summary
Dans ce protocole, nous avons décrit une nouvelle méthode pour étudier l'influence de l'hétérogénéité des cellules gliales sur la croissance des axones avec un
Abstract
Dans le système nerveux central de tous les mammifères, les axones sectionnés après une blessure sont incapables de se régénérer à leurs objectifs initiaux et la récupération fonctionnelle est très pauvre 1. L'échec de la régénération des axones est le résultat combiné de plusieurs facteurs, notamment l'environnement des cellules gliales hostile, inhibition des molécules liées et une diminution de la myéline des neurones intrinsèques de régénération capacité 2. Les astrocytes sont les cellules les plus prédominantes gliales dans le système nerveux central et de jouer un rôle important dans les fonctions axone sous la physiologie et la pathologie des conditions 3. Contraste pour les oligodendrocytes homologues, les astrocytes sont une population cellulaire hétérogène composé par différentes sous-populations d'astrocytes avec des morphologies différentes et 4 l'expression des gènes. La signification fonctionnelle de cette hétérogénéité, comme leurs influences sur la croissance des axones, est largement inconnue.
Pour étudier les cellules gliales, en particulier la fonction de l'hétérogénéité des astrocytes dans le comportement des neurones, nous avons établi une nouvelle méthode de co-culture de haute purifiée dorsale neurones ganglions de la racine avec des cellules gliales obtenu à partir du cortex de rat. Par cette technique, nous avons pu comparer directement l'adhérence et la croissance des axones des neurones sur les sous-populations différentes astrocytes dans les mêmes conditions.
Dans ce rapport, nous donnons le protocole détaillé de cette méthode pour l'isolement et la culture des astrocytes, neurones ganglions de la racine dorsale isolement et de purification, et la co-culture de neurones avec GHM astrocytes. Cette méthode pourrait également être étendu aux autres régions du cerveau à l'étude cellulaire ou régionales interaction spécifique entre neurones et cellules gliales.
Protocol
1. Culture cellulaire Glia
Les cellules gliales peuvent être cultivées à partir de différentes régions du système nerveux central. L'ensemble du processus est montré dans la figure processus.
Jour 1 plaque de culture de revêtement et des lamelles
- Dry rondes stérilisés lamelles de microscope en verre dans un autoclave.
- Plaque les lamelles stérilisés dans la plaque de culture stérilisé de 24 puits.
- Enduire les lamelles avec de la poly-lysine et incuber pendant 2 heures sous une température racine.
- Manteau plaques de culture de 6 puits de la même manière qu'à l'étape 3.
- Lavez les lamelles et la plaque de culture de 6 puits à deux reprises avec de l'eau distillée et sécher à l'air dans le capot de la culture.
- Ajouter 200 pl de milieu DMEM (10% de FBS) dans chaque puits de la plaque de 24 puits et 2 ml dans chaque puits de la plaque à 6 puits et les mettre en étuve à 37 degrés avec 5% de CO 2
Jour 2 du cortex isolation et de culture de cellules gliales
- Stériliser la hotte à flux positifs de dissection.
- Allumez la lumière UV pendant 20 min.
- Pulvériser sur toutes les surfaces avec de l'éthanol 70% et attendre 15 minutes avant utilisation.
- changement de tension: les ratons Anesthetize (P2-P6) par l'hypothermie, et décapiter à la base du magnum framen l'aide de ciseaux d'exploitation.
- Ouvrez la boîte crânienne le long de la suture sagittale en utilisant un ciseau d'iris et de décoller le crâne.
- Enlever le cerveau et les mettre en réfrigérée milieu L15, sous stéréomicroscope, nettoyer soigneusement la membrane-mère et pie avec des vaisseaux sanguins, d'isoler le cortex et laver plusieurs fois avec du milieu L15.
- Couper le cortex en petits morceaux avec des ciseaux de microchirurgie.
- Ajouter 0,125% de trypsine-EDTA préparé avec du milieu L15 en morceaux le cortex et incuber à 37 degrés pendant 15 min.
- Transfert des blocs de tissus dans un milieu DMEM 20mL avec du FBS 20% en tube 50ml, ajouter à la solution mère de DNase 10ug/mL concentration finale, aspirer la solution des tissus haut et en bas pendant 20 heures avec le feu en verre poli Pasteure pipette, de recueillir la suspension seule cellule.
- Laver les cellules en suspension une fois avec du milieu DMEM, rétablir la suspension des cellules dans du DMEM avec 10% de FBS, compter les cellules sous le microscope des cellules hémocytomètre une graine, à 5000-10000/cm 2. Maintenir les cellules dans un 37 degrés incubateur à 5%, le changement de la moitié des 2 moyennes fois par semaine.
2. Ganglions de la racine dorsale Neurones isolement, de la Culture et de purification
Jour 1 Préparer le matériel de la culture
- Enduire les lamelles stérilisés à la poly-lysine lamelles de lavage, deux fois avec distiller l'eau et l'air sec, les mettre dans des plaques 24 puits.
- Ajouter 100 ul milieu Neurobasal avec 2% B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml), mettre la plaque en 37 CO degré 5% 2.
Jour 2 Isoler les GHM à partir d'embryons
- Stérilisé la hotte à flux de la même manière que la culture de cellules gliales.
- Euthanasier un rat enceintes (E15) par overdose avec du CO 2, de l'abdomen stérilisés par 70% d'éthanol, les embryons ont été isolées de l'utérus et de mettre en réfrigérée milieu L15.
- Isoler avec des moelles épinières ganglions de la racine dorsale connecté sous stéréomicroscope et transfert à 35mm avec des plats refroidis milieu L15.
- Recueillir suspension cellulaire unique et se laver une fois avec la FBN (milieu Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml)).
Jour 3 Purifier neurones DRG
- 18h-24h après le semis neurone, ajouter une solution concentrée à 1 mM de stock FUDR à la culture de neurones à une concentration finale de 20 pM et un volume final de 200 pl.
- 72h plus tard, de remplacer la moitié de la moyenne avec milieu Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50ng/mL) sans FUDR. Après cela, changer le milieu tous les autres jours.
3. Coculture avec des neurones DRG cellules gliales
- Lorsque la culture de cellules gliales atteint la confluence (environ 20 jours après le semis), ils étaient prêts à co-culture avec les neurones.
- 24 heures avant d'ajouter les neurones purifiés, gliales cellules moyennes ont été changées à moyen Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50 ng / ml).
- Neurones purifiés ont été recueillies à partir des puits de culture, seule la suspension des cellules ont été obtenues par le passage mécanique grâce à la pipette Pasteure polies au feu.
- Après avoir compté le nombre, les neurones ont été ensemencées à confluence 500/cm 2 sur les cellules gliales dans le milieu de Neurobasal contenant 2% de B27 et 2.5S NGF (50ng/mL).
- L'adhérence et la croissance neuritique des neurones sur les cellules gliales pourraient être enregistrées et analysées à différents moments par des logiciels d'analyse d'image et l'immunocytochimie utilisant des anticorps de type cellulaire spécifique.
4. Les résultats représentatifs
- Culture de cellules gliales: Après l'ensemencement, les cellules gliales deviennent confluentes environ 20 jours. Sous microsc contraste de phaseOPE, il a été facilement identifiés que les différentes sous-populations de cellules gliales morphologiques différentes sous-structures formées modèle de croissance et les astrocytes GFAP positives représentaient plus de 90% comme indiqué par la technique immuocytochemisty (Figure 1, Figure 2).
- DRG neurones de la culture: Dans notre méthode, après 72 heures de traitement FUDR, la pureté des neurones DRG atteindra aussi élevé que 99% dans les 6 jours, les neurones DRG ont montré leurs morphologies et unique avec une croissance de densité des neurites élevé (figure 3, figure 4).
- Gliales et neurones coculture de cellules: les neurones et l'adhérence DRG neurites survenue facilement sur les cellules gliales dans les 4 heures après l'ensemencement, l'observation minutieuse a montré que l'adhésion des neurones et la croissance des neurites ont été influencés par les sous-populations de cellules gliales qui forment spéciale soubassements modèle de croissance, ce qui pourrait être facilement identifiés sous le microscope à contraste de phase et par immunocytochimie (Figure 5, Figure 6).
Figure 1. Morphologie des cellules gliales confluentes. Corticales cellules gliales ont été plaqués sur la lamelle revêtement polylysine et cultivées pendant 20 jours, notez le modèle de croissance différents de cellules gliales, les cellules sur le côté gauche disposés de manière rayonnée.
Figure 2. Confluent cellules gliales étiquetés par la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP) anticorps. Notez la disposition rayonnée de la GFAP (en rouge) des cellules positives sur le côté droit.
Figure 3. Dorsale neurones ganglions de la racine a grandi in vitro, sans traitement FUDR. Les cellules contaminantes formé DRG fond neurones ».
Figure 4. Dorsale neurones ganglions de la racine a progressé après un traitement in vitro de FUDR. Les cellules de fond contaminant avait été complètement éliminé.
Figure 5. Dorsale neurones ganglions de la racine cultivée sur cellules gliales. Adhérence neurones et la croissance des neurites étaient inhibés sur les cellules rayonnée arrangé et limitée sur les cellules gliales côté droit.
Figure 6. Dorsale neurones ganglions de la racine de croissance sur les cellules gliales étiqueté par l'anticorps neurofilaments. Les neurites (vert) ont été inhibés sur le rayonnée disposées les cellules gliales côté gauche et limité sur le côté droit, toutes les cellules gliales ont été marqués par des anticorps GFAP (en rouge).
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Discussion
Ce protocole expérimental a été conçu pour atteindre deux objectifs d'étudier les cellules gliales, l'influence en particulier l'hétérogénéité des astrocytes sur l'adhésion des neurones et la croissance des neurites. Le premier objectif était de maintenir l'hétérogénéité des astrocytes autant que possible, dans cette expérience, la confluence des cellules gliales de la culture des astrocytes a été mélangé enrichi la culture primaire sans aucun traitement chimique et de la propagation de digestion, ce qui peut endommager davantage la cellule et induire une réponse des blessures des astrocytes. La pureté finale astrocyte est supérieure à 90% GFAP positives, avec des fibroblastes de contamination inférieur à 1% comme l'a vérifié fibrobasts FN. La densité de semis à faible au début de cellules fait subir plusieurs cycles de division avant la confluence. Sous microscope à contraste de phase, l'hétérogénéité des cellules gliales a été observée par la sous-structure formée par différentes différentes astrocytes morphologiques. Le deuxième objectif était d'obtenir de haute neurones DRG purifiés et les co-culture avec des cellules gliales d'étudier l'influence sur le comportement des neurones hétérogénéité. Cellules contaminantes dans les ganglions de la racine dorsale, comme les fibroblastes et les cellules de Schwann pourrait apparemment influencer ou de modifier la croissance des axones dans des conditions de culture 5, 6, pour éviter cette influence indésirable, les neurones DRG ont été cultivées dans un milieu sans sérum et traités par FUDR pour 72h de tuer tous les autres types cellulaires. Après ce traitement, les neurones DRG pourrait être purifiée aussi élevé que 99%. Il a été plus efficace que la méthode traditionnelle qui a besoin de traiter la culture des neurones à plusieurs reprises 7. Simple d'adhésion neurone DRG et la croissance des axones peuvent être facilement surveillés et suivis au microscope à contraste de phase par l'enregistrement laps de temps et la méthode d'analyse d'imagerie, leur interaction avec les cellules gliales pourrait être analysée en détail par immunocytochimie et la technique de microscopie électronique.
Il a été noté que les neurones DRG ne pouvait pas être maintenues in vitro depuis plus de quatre semaines, leur survie avait aucun signe de réduction, mais ils ne pouvaient pas adhérer au substrat plus longtemps, généralement ils se détacher et rouler.
Neurones DRG pourrait être maintenue sur les cellules astrogliales pendant une longue période (plus de 2 mois). Cette coculture à long terme entre les neurones DRG haute purifiée et les astrocytes faire le suivi des neurones individuels et la croissance des axones sur les différents types d'astrocytes plus facilement, il a également d'éviter l'influence incontrôlée des cellules de contamination d'autres dans les ganglions de la racine dorsale. Pendant le processus de toute une culture, toutes les cellules doivent être manipulés avec soin et toutes les cellules doivent toujours être immergés dans un milieu de culture. Pour obtenir de haute neurones DRG pureté, un point critique est la durée du traitement FUDR, plus de 72h de traitement sera considérablement compromis la viabilité cellulaire et le traitement court laps de temps ne peut pas tuer toutes les cellules de contamination. Dans des conditions optimales, nous pouvons obtenir grande quantité de neurones DRG haute pureté dans 1 semaine. L'utilisation de ce système de coculture, nous avons constaté que, contrairement aux croyances répandues, les astrocytes hétérogènes avaient des influences différentes sur l'adhésion des neurones et la croissance des axones et les astrocytes sous-population a montré une forte inhibition de l'adhérence des neurones et la croissance axonale. Outre l'interaction entre les astrocytes et la croissance des axones, cette méthode pourrait être utilisée dans d'autres études telles que formation de la myéline, les changements dans la capacité de développement neuronal axone croissance intrinsèque, les gènes et les voies de signalisation associées à la croissance axonale. Il peut également être utilisé chez la souris et autres animaux des régions centrales du système nerveux d'étudier l'interaction entre neurones et cellules gliales.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par FMMU nouvelle fondation et trouver le financement partiel du NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | |
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | |
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| poly-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | culture grade |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | |
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move? J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
