Detta protokoll beskriver en metod för mikrometerstorlek tredimensionell avbildning av syrekoncentrationen i den närmaste omgivningen av levande celler genom att elektronens spin resonans mikroskopering.
Detta protokoll beskriver en elektron spin resonans (ESR) mikro-imaging metod för tredimensionell kartläggning av syrehalten i den närmaste omgivningen av levande celler med micron skala upplösning 1. Syre är en av de viktigaste molekylerna i cykeln av liv. Den fungerar som terminal elektronacceptor av oxidativ fosforylering i mitokondrierna och används i produktionen av reaktiva syreradikaler. Mätningar av syrgas är viktiga för att studera mitokondriella och metabola funktioner, signalvägar, effekter av olika stimuli, permeabilitet och sjukdom differentiering. Syreförbrukning är därför en informativ markör av cellulär metabolism, vilken i stort gäller för olika biologiska system från mitokondrier till celler till hela organismer. På grund av dess betydelse, har många metoder utvecklats för mätning av syre i levande system. Aktuella försök att ge hög upplösning syre avbildning är huvudsakligen baserade på optiska fluorescens och fosforescens metoder som inte ger tillfredsställande resultat när de anställer sonder med hög foto-toxicitet och låg syre känslighet. ESR, som mäter signalen från exogena paramagnetiska sonder i urvalet, är känd för att ge mycket exakta mätningar av syrehalten. I ett typiskt fall ESR mätningar karta sondens lineshape breddning och / eller avslappning i tid förkorta som är kopplade direkt till den lokala syrehalten. (Syre är paramagnetiska, och därför vid kollision med den exogena paramagnetiska sonden, den korta sina avkoppling gånger.) Tidigare har dessa typer av experiment som utförs med låg upplösning, millimeter skala ESR för smådjur avbildning. Här visar vi hur ESR bildbehandling också kan utföras i micron skala för undersökning av små lever prover. ESR mikro-avbildning är en relativt ny metod som möjliggör förvärv av rumsligt-löst ESR signaler med en upplösning som närmar sig 1 mikron i rumstemperatur 2. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll-papper är att visa hur denna nya metod, tillsammans med nyutvecklade syrekänsliga sonder, kan tillämpas på kartläggning av syrehalten i små lever prover. En rumslig upplösning på ~ 30 x 30 x 100 ìm visas, med nästan mikromolära syrehalt känslighet och sub-femtomole absolut syre känslighet per Voxel. Användningen av ESR mikro-avbildning för syre kartläggning nära cellerna kompletterar nu tillgängliga tekniker som bygger på mikro-elektroder eller fluorescens / fosforescens. Dessutom med rätt paramagnetiska sonden blir det också lätt tillämpliga för intracellulär syre mikro-avbildning, en förmåga som andra metoder få mycket svårt att uppnå.
Detta protokoll visar hur ESR mikro-avbildning kan användas för att kartlägga syrekoncentration nära Live små prover. En rumslig upplösning på ~ 30 x 30 x 100 ìm visas, med nästan mikromolära syrehalt känslighet och sub-femtomole absolut syre känslighet per Voxel. Användningen av ESR mikro-avbildning för syre kartläggning nära cellerna kompletterar nu tillgängliga tekniker som bygger på mikro-elektroder eller fluorescens / fosforescens. Dessutom med rätt paramagnetiska sonden kommer det att vara lätt tillämpliga för intracellulär syre mikro-avbildning, en förmåga som andra metoder få mycket svårt att uppnå. Inom den närmaste framtiden planerar vi för att ytterligare förbättra denna metod för att ge live-prov bilder med en upplösning på några mikrometer, som ger kontrast parametrar som super oxid koncentration, surhetsgrad (pH), sond diffusionskoefficient och, naturligtvis, syrehalt. Dessa funktioner är ett komplement till den nuvarande optiska-baserade metoder både vad gäller kontrast typ och även av prover egenskaper (t.ex. icke-transparenta tjocka prover och i vissa fall, intracellulära vs extracellulära mätningar).
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | ||
Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |||
BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | |||
Syringe | Hamilton | Microliter 7000.5 | ||
Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |