Summary
在这篇文章中，我们提出一个简单的方法，使长期
Abstract
了解驱动器正常和畸形的胚胎发育的遗传和微环境因素之间的关系，为发现新的治疗策略的根本。成像技术的进步已使定量调查的组织和成熟的身体计划，但后一阶段的胚胎形态发生目前还不太清楚。鸡胚胎是一个有吸引力的脊椎动物为这个应用程序的模型系统，因为它的文化和手术操作方便。早期胚胎可以培养一个短的时间在滤纸上环，从而使光纤接入完整的细胞图案和命运的研究1,2。学习先进的，如心脏的形态发生发育过程中，传统上通过一个窗口蛋壳3-5，但这种技术限制了光纤接入，由于窗口大小。我们以前开发的一个简单的方法来文化的整个胚胎前，OVO六角权衡船最多至10天，这使得通过高分辨率成像超声6,7。这些文化，运输困难，限制了可用于现场实验的成像工具的类型。我们在座改善与成本效益，便携式环境室的无壳培养体系。鸡蛋被破解到圆周部分用无菌水填充到塑料杯贴上由聚氨酯膜（保鲜）创建了一个吊床。吊床的周长和深度尺寸均保持表面张力的关键，而下的吊床和水力学有助于抑制由运输引起的震动。还开发了一个小的足迹，循环水浴，使实验过程中连续的温度控制。我们证明至少14天的能力，在这样的文化胚胎的无形态发生缺陷或延迟，并聘请几个显微和成像应用这个系统。
Protocol
1， 前OVO文化协议：
- 孵育受精鸡蛋
- 受精鸡蛋可以保存在13 ° C可高达5天前孵化没有启动发展。一个红酒柜可以保持这个温度。
- 孵育鸡蛋钝端，72小时连续摇动60％的恒温恒湿培养箱在37.5 ° C。
- 准备吊床（图1a）
- 填写¾ 9盎司塑料杯温暖的无菌水。一个普通的9安士杯有一个直径8厘米的顶部。我们发现，这个大小是最适合长时间的文化这里介绍的应用程序。
- 剪下约20厘米，保鲜。贴上环杯的顶部放置一个橡皮筋周围。塑料应在水面上传播。周围带剪下多余的塑料。我们发现，保鲜到这个应用程序是最适当的，因为它可以防止蛋黄的粘连，导致在运输过程中的蛋黄分裂。
- 擦拭kimwipes用70％乙醇湿（金佰利公司）的塑料。
- 取出鸡蛋从孵化器，孵化后72小时。
- 消毒用70％乙醇湿kimwipes擦拭表面的蛋。
- 水平打好的鸡蛋胚胎的正确定位（图1b）为1-2分钟。一个鸡蛋纸箱可用于产卵水平。 1-2分钟后，胚胎将旋转顶端。
- 吊床胚胎转移到无菌层流罩。
- 使用锋利的边缘（如金属桶或玻璃烧杯边缘），轻轻地挖掘鸡蛋，直到有一个蛋（图1c）底部的小凹痕。记住，胚胎的位置上upperside。
- 凹痕两侧竖起大拇指，除了横向拉的炮弹（图1d）。
- 将蛋黄与胚胎以及白蛋白到吊床（图1E）。白蛋白会提供缓冲环境，吸收周围的蛋黄移动系统以及悠久的文化实践的胚胎提供营养，因为它引起的冲击。吊床下面的水将确保胚胎将保持与地面平行，在运输过程中，在成像作为一种热导体，如果循环水加热器使用。
- 胚胎应该已经被定位在上面，如果转让是正确执行。如果不是这样，使用一个非锐化的，无菌的对象（即封闭的弧形剪刀钝尖）和定向爱抚胚胎旋转顶端的蛋黄。
- 将一个直径10厘米，杯上的培养皿密封胚胎。
- 放入孵化器设置的世界杯文化在37.5 ° C。如果便携式孵化器是用来放置1-2 9盎司杯充满蒸馏水的湿度保持在〜60％（图1F）。
- 如果超越胚胎第7天的培养胚胎，压碎的蛋壳碎片散落在周边的胚胎作为对骨骼发育和成熟的钙源。
孵化器外成像/操纵的辅助设备：
房子建一个循环水浴中保持孵化温度而成像或操纵（图3）。可以容纳杯水浴连接，通过适当的大小管水水库。一个电阻加热器加热水库的水，这是受以下水温手动。一台水泵循环水。图画代表性描绘成像轻松通过ultrasongraphy / florescent显微镜（图3）。
图1。吊床的制备及鸡胚胎转移到吊床。
图2。代表性的结果-通过前OVO栽培技术种植的不同阶段鸡胚胎的胚胎从农户17日起，通过这种技术可以种植。
图3。 前OVO文化系统结合使用，以保持在理想的开发温度胚胎的水循环系统的原理图和有代表性的图片。
2。选定的应用程序：
一，显微注射
这个胚胎培养适合显微注射的应用解决方案需要注射到血管成像对比（即荧光显微镜，微型计算地形等）（图4）。下面是显微注射的协议：
- 准备注射appara。TUS
- 时尚0.75编号玻璃毛细管拉成斜面尖端microforge使用微针。需要提示的大小取决于目标静脉直径/流量所需的速率。
- 0.03英寸内径硅胶管连接注射器。
- 被注入的解决方案负载油管和油管连接的微针。
- 将注射器持有人或注射泵上的显微操纵器和注射器的微针。
- 添加无菌水在杯子里，从而提高胚胎。我们经验丰富的，适当的针头进入血管（即卵黄船只）的渗透，横向穿透力是必要的。这需要胚胎作为同一平面上的杯子的边缘上。
- 下胚胎的塑料取出橡皮筋。
- 塑料一侧轻轻抬起，并添加一些无菌水的杯子。
- 橡皮筋固定到塑料。
- 注入胚胎血管的解决方案。根据我们的经验，当溶液注入到卵黄船只，微针需要血管直径大小约为1 / 10 日 ，以保持高效的灌注而引起出血。
- 泵的解决方案，以确保没有气泡形成的微针。
- 微针的尖端对齐到选定的船舶。卵黄船只，选择一个叉面积会给穿透船只的最大面积。
- 对船只的推针。船只将首先收回。一旦针头穿透，开始灌注。流淌的血液的颜色应与灌注变化。如果没有看到颜色的变化是，针可能已经渗透出的船只。在这种情况下，慢慢收回的微针，同时抽水解决方案，直到看到颜色的变化是在船只。灌注完成后，收回的微针的船只。
图4：微量注射进入前 OVO培养的鸡胚血管荧光染料。
二。显微程序 - 结扎左心房
这当然OVO文化设置理想的执行，因为它提供了完整的无障碍胚胎手术应用鸡胚。下面是一个例子技术的协议，左心房结扎（鲎）（图5）。该程序执行了约24小时到文化时期（HH24）：
- 准备上手节〜0.5毫米直径，用10-0尼龙手术缝合。
- 精细镊子，本地删除在胚胎绒毛尿囊膜，从后面抬胚胎垂直旋转等，左侧是可见的胚胎。
- 用细镊子，取出左心房心包。
- 对齐左心房结，并拧紧。应绑结，禁止原有的血流到左边〜75％。切结与microscissors的边缘，小心地取下和丢弃多余的缝线。
- 旋转胚胎回其原始方向的（在右上方）。
- 深水控制将涉及相同的步骤，但缝合只会通过并没有太大的。鲎有效的治疗（75％缢）将在24小时内手术后证实，被取消资格的胚胎将被排除在外。
图5：一个控制和左心房结扎鸡胚箭头显示左心房，这是在结扎胚胎较小的约75％。
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Discussion
光纤接入和禽流胚胎实验是具有挑战性的，由于约束的鸡蛋壳。窗口大大限制了微血管注射和显微外科方法8访问人数。因此，只有早期胚胎可以被操纵，并连续观察是不可能的。使用培养皿的早期前 OVO文化的用途有限，因为控制不力，对胚胎的表面张力，防止长期文化9。最近，我们改进了这种技术，使用一个六角形的权衡船保持可接受的表面tenstion 7，但这些文化，运输困难。这里介绍的技术可以解决这个问题，并大大扩展了实验方法和成像技术，包括显微注射和手术过程中，可以采用的类型。作为研究重点是了解后形态发生的事件，这种技术将使目前是不可能的实验研究不断发展事件的监测和调制的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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