Een Ex-ovo Chicken Embryo Cultuur systeem geschikt voor Imaging en microchirurgie toepassingen
Summary
In dit artikel presenteren we een eenvoudige methode om op lange termijn in staat stellen<em> Ex-ovo</em> Aviaire embryo cultuur. Deze techniek is ideaal voor longitudinale experimenten die volledig optische toegankelijkheid en / of steriel vervoer in aviaire embryo's.
Abstract
Het begrijpen van de relatie tussen genetische en microenvironmental factoren die de normale en misvormde embryonale ontwikkeling te stimuleren van fundamenteel belang is voor het ontdekken van nieuwe therapeutische strategieën. De vooruitgang in imaging technologie in staat hebben gesteld kwantitatief onderzoek van de organisatie en de rijping van het lichaam plan, maar later stadium embryonale morfogenese is minder duidelijk. Kippenembryo's zijn een aantrekkelijk gewervelde dier modelsysteem voor deze toepassing vanwege het gemak van cultuur en chirurgische manipulatie. Vroege embryo's kunnen worden gekweekt voor een korte tijd op filtreerpapier ringen, die volledig optische toegang voor mobiele patronen en het lot studies 1,2 mogelijk maakt. Het bestuderen van geavanceerde ontwikkelingsprocessen zoals hart-morfogenese zijn traditioneel uitgevoerd door een raam van de eischaal 3-5, maar deze techniek beperkt optische toegang vanwege venster grootte. We hebben eerder ontwikkelde een eenvoudige methode om de cultuur gehele embryo's ex-ovo op zeshoekige wegen boten voor maximaal 10 dagen, die een hoge resolutie imaging ingeschakeld via echografie 6,7. Deze culturen waren moeilijk te vervoeren, het beperken van de aard van de imaging tools beschikbaar zijn voor live-experimenten. We hebben hier aanwezig zijn een verbeterde shell-minder cultuur-systeem met een kosten-effectieve, draagbare klimaatkamer. Eieren waren gebarsten op een hangmat gemaakt door een polyurethaan membraan (klampen wrap) langs de omtrek aangebracht op een plastic bekertje gedeeltelijk gevuld met steriel water. De afmetingen van de omtrek en de diepte van de hangmat waren zowel kritisch naar de oppervlakte spanning te behouden, terwijl de mechanica van de hangmat en water onder hielp dempen trillingen veroorzaakt door het transport. Een kleine footprint circulerend waterbad werd ook ontwikkeld om constante temperatuurbeheersing tijdens experimenten mogelijk te maken. Tonen we de mogelijkheid om embryo's in de cultuur op deze wijze gedurende ten minste 14 dagen zonder morfogenisch defect of vertraging en dit systeem gebruiken in verschillende microchirurgische en imaging toepassingen.
Protocol
Discussion
Optische toegang en experimenten in het aviaire embryo's is een uitdaging vanwege beperkingen van de eierschaal. Window beperkt aanzienlijk het aantal microvaten toegankelijk voor injectie en microchirurgische benadering 8. Als gevolg daarvan alleen maar vroege embryo's kunnen worden gemanipuleerd en continue observatie is niet mogelijk. Begin van de ex-ovo culturen met behulp van Petri schalen waren slechts beperkt bruikbaar vanwege de ontoereikende controle op de oppervlaktespanning op het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertile white Leghorn chicken eggs | ||||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | ||||
| Saran Wrap | ||||
| Kimwipes | Kimberly-Clark, Inc. | |||
| Rubber bands | ||||
| Warm sterile water | ||||
| 9 oz plastic cup | ||||
| 100 mm diameter Petri dish | ||||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing CO, Savannah GA | |||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma Aldrich Inc. | |||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | |||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | ||||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Sarasota FL | Model M3301L | ||
| Fluorescent microscopy | Zeiss | Z20 | ||
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Sarasota FL | |||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | |||
| Tubing | VWR | 1mm OD | ||
| 3 mL syringe | BD | |||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
