Summary
In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um langfristig zu ermöglichen
Abstract
Das Verständnis der Zusammenhänge zwischen genetischen und Mikroumgebung Faktoren, die normale und fehlerhafte embryonale Entwicklung Laufwerk ist von grundlegender Bedeutung für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien. Fortschritte in der Imaging-Technologie haben die quantitative Untersuchung der Organisation und Reifung des Körpers Plan aktiviert, aber später embryonalen Morphogenese ist weniger klar. Hühnerembryonen sind eine attraktive Wirbeltier-Modellsystem für diese Anwendung wegen seiner Leichtigkeit von Kultur und chirurgische Manipulation. Frühe Embryonen können für eine kurze Zeit auf Filterpapier Ringe, die komplette optische Zugang für die Zell-Strukturierung und Schicksal Studien 1,2 ermöglicht kultiviert werden. Studieren fortgeschrittenen Entwicklungsprozessen, wie Herz-Morphogenese sind traditionell durch ein Fenster der Eischale 3-5 durchgeführt, aber diese Technik Grenzen optischer Zugang durch Fenstergröße. Wir zuvor entwickelte eine einfache Methode zur Kultur ganzen Embryonen ex-ovo auf sechseckigen wiegen Boote für bis zu 10 Tage, die hochauflösende Bildgebung mittels Ultraschall 6,7 aktiviert. Diese Kulturen wurden schwer zu transportieren, wodurch die Arten von Imaging-Tools für Live-Experimente. Wir stellen hier eine verbesserte Shell-less Kultur mit einem kostengünstigen, tragbaren Klimakammer. Die Eier wurden auf einer Hängematte mit einem Polyurethan-Membran (Frischhaltefolie) ringförmig an einem Plastikbecher teilweise mit sterilem Wasser gefüllt angebracht erstellt geknackt. Die Abmessungen des Umfangs und der Tiefe der Hängematte waren beide entscheidend für die Oberflächenspannung zu halten, während die Mechanik der Hängematte und Wasser unter geholfen dämpfen Vibrationen, die durch den Transport induziert. Eine kleine Stellfläche zirkulierenden Wasserbad wurde auch entwickelt, um kontinuierliche Temperaturkontrolle während der Experimente zu ermöglichen. Wir zeigen die Fähigkeit, Kultur Embryonen auf diese Weise für mindestens 14 Tage ohne morphogenic Defekt oder Verzögerung und beschäftigen dieses System in mehreren mikrochirurgischen und Imaging-Anwendungen.
Protocol
. 1 Ex-ovo Kultur-Protokoll:
- Inkubieren befruchtete Hühnereier
- Befruchtete Hühnereier können bei 13 ° C gelagert werden bis zu 5 Tage vor der Inkubation ohne Einleitung Entwicklung. Ein Rotwein Kühler kann diese Temperatur.
- Inkubieren Eier stumpfe Seite nach oben in eine 60% ige konstante Luftfeuchtigkeit Inkubator mit kontinuierlichem Schütteln bei 37,5 ° C für 72 Stunden.
- Bereiten Hängematten (Abbildung 1a)
- Füllen ¾ 9 Unzen Plastikbecher mit warmem sterilem Wasser. Eine regelmäßige 9 Unzen Tasse hat einen oberen Durchmesser von 8 cm. Wir fanden, dass dieser Größe am besten geeignet für lange Kultur-Anwendung präsentiert hier war.
- Cut ca. 20 cm Frischhaltefolie. Befestigen Sie den Umfang auf der Tasse, indem ein Gummiband herum. Plastic sollte auf der Wasseroberfläche verteilt werden. Schneiden Sie die überschüssige Kunststoff rund um die Band. Wir fanden Frischhaltefolie am geeignetsten für diese Anwendung, da sie die Haftung der Dotter verhindert, was in den Dotter Spaltung während des Transports.
- Wischen Sie die Plastik mit Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) mit 70% Ethanol benetzt.
- Entfernen Sie Eier aus Inkubator nach 72 Stunden Inkubationszeit.
- Sterilisieren Eier durch Abwischen mit 70% Ethanol benetzt Kimwipes.
- Legen Sie die Eier horizontal für 1-2 Minuten für die richtige Positionierung des Embryos (Abb. 1b). Ein Eierkarton kann Eier legen horizontal verwendet werden. Embryonen nach oben nach 1-2 Minuten zu drehen.
- Transfer-Embryonen auf Hängematten aseptisch in einer Sterilbank.
- Mit einer scharfen Kante (wie die Kante eines Metall-Eimer oder ein Becherglas), tippen Sie auf das Ei vorsichtig, bis es eine kleine Delle an der Unterseite des Eies (Abbildung 1c). Denken Sie daran, den Embryo auf der Oberseite positioniert.
- Legen Sie den Daumen in den gegenüberliegenden Seiten des dent und ziehen die Schalen horizontal auseinander (Abbildung 1d).
- Legen Sie das Eigelb mit Embryo sowie Albumin auf die Hängematte (Abbildung 1e). Albumin wird einen dämpfenden Umgebung rund um das Eigelb geben, Schocks, indem Sie das System sowie die Ernährung bietet, den Embryo für lange Kultur Praktiken induzierte absorbieren. Wasser unter der Hängematte wird dafür sorgen, den Embryo wird parallel bleiben, um den Boden beim Transport und dienen als Wärmeleiter während der Bildgebung, wenn ein Wasserkreislauf Heizung verwendet wird.
- Der Embryo ist bereits oben positioniert werden, wenn die Übertragung korrekt durchgeführt wird. Wenn nicht, verwenden Sie eine unscharfe, sterile Objekt (zB Blunt Spitze geschlossen gebogene Schere) und direktional streicheln das Eigelb, dass der Embryo nach oben dreht.
- Legen Sie eine 10 cm Durchmesser Petrischale auf dem Becher, den Embryo zu versiegeln.
- Legen Tasse Kultur in den Inkubator gesetzt bei 37,5 ° C. Wenn ein tragbarer Inkubator verwendet wird, indem 1-2 9 Unzen Becher mit destilliertem Wasser gefüllt hält die Feuchtigkeit auf ~ 60% (Abbildung 1f).
- Wenn Kultivierung Embryonen außerhalb embryonalen Tag 7 sollten zerdrückt Eierschale Stücke rund um die Peripherie des Embryos als Kalzium-Quelle für die Entwicklung der Knochen und die Reifung verstreut werden.
Zusatzausrüstung für außerhalb Inkubator Imaging / Manipulation:
Ein zirkulierendes Wasserbad wurde im Haus gebaut, um Inkubationstemperaturen zu halten, während Bildgebung oder Manipulation (Abbildung 3). Ein Wasserbad, dass die Tasse passen kann, ist über entsprechende Größe Schlauch an ein Wasser-Reservoir verbunden. A Widerstandsheizung erwärmt das Wasser in das Reservoir, das manuell, indem Sie die Wassertemperatur geregelt. Eine Wasserpumpe sorgt für die Wasserzirkulation. Bildliche Darstellung zeigt Bildgebung bequem über ultrasongraphy / florescent Mikroskopie (Abbildung 3).
Abbildung 1. Vorbereitung der Hängematte und die Übertragung von Hühnerembryonen zu Hängematten.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse -. Unterschiedlichen Stadium Hühnerembryonen via ex ovo Kultur Technik gewachsen Embryonen aus HH 17 seit über diese Technik angebaut werden.
Abbildung 3. Schematische und repräsentative Bilder der Wasserkreislauf in Verbindung mit dem ex-ovo Kultur System verwendet, um Embryonen zu idealen Entwicklung Temperatur zu halten.
2. Ausgewählte Anwendungen:
I. Mikroinjektion
Dieser Embryo Kultur ist geeignet für die Mikroinjektion Anwendungen, bei denen Lösungen müssen injiziert werden, um für den Kontrast für die Bildverarbeitung (zB Fluoreszenz-Mikroskopie, Mikro-Computertomographie etc.) (Abbildung 4) Gefäßsystem werden. Unten ist die Mikroinjektion Protokoll:
- Bereiten Sie die Injektion apparatus
- Fashion gezogen 0,75 ID Glaskapillaren in abgeschrägte Spitze Mikronadeln mit einem microforge. Größe der Spitze hängt von Ziel Venendurchmesser / Durchfluss gewünscht.
- Verbinden Sie die Spritze auf 0,03 Zoll ID Silikonschlauch.
- Legen Sie den Schlauch mit der Lösung injiziert werden und verbinden Sie die Mikronadel, um den Schlauch.
- Legen Sie die Mikronadel auf den Mikromanipulator und Spritze zu Spritze Inhaber oder Spritzenpumpe.
- Add sterilem Wasser in die Tasse damit erhöhen den Embryo. Wir erfahren, dass für eine ordnungsgemäße Eindringen der Nadel in ein Blutgefäß (dh vitelline Schiff), horizontale Durchdringung notwendig ist. Dies erfordert den Embryo auf der gleichen Ebene wie die Ränder des Bechers sein.
- Nehmen Sie das Gummiband hält der Kunststoff unter der Embryo.
- Heben Sie die eine Seite der Kunststoff leicht und fügen Sie einige sterilem Wasser in die Tasse.
- Sichern Sie das Gummiband auf den Kunststoff wieder.
- Injizieren Sie die Lösung in einen embryonalen Gefäß. In unserer Erfahrung, wenn Lösung für ein vitelline Gefäß injiziert wird, Mikronadeln benötigt, um einer Größe von ungefähr 1 / 10 th der Gefäßdurchmesser, um eine effiziente Perfusion ohne Blutungen zu halten.
- Pump die Lösung für die Sicherstellung Mikronadel keine Bildung von Luftblasen.
- Richten Sie die Spitze des Mikronadel auf das ausgewählte Schiff. Für vitelline Schiffe wird durch die Auswahl einer Gabel Bereich geben maximale Fläche für das Schiff eindringt.
- Drücken Sie die Nadel in Richtung des Schiffes. Das Schiff wird zuerst eingezogen. Sobald die Nadel eindringt, beginnen Perfusion. Die Farbe des strömenden Blutes sollte mit Perfusion ändern. Wenn Farbwechsel nicht gesehen wird, kann die Nadel aus dem Schiff eingedrungen sind. In diesem Fall langsam einfahren Mikronadel gleichzeitig Pumpenlösung bis Farbwechsel in das Schiff zu sehen ist. Sobald die Durchblutung abgeschlossen ist, zurückziehen Mikronadel aus dem Behälter.
Abbildung 4: Mikroinjektion von einem fluoreszierenden Farbstoff in das Gefäßsystem eines Ex-ovo kultivierten Hühnerembryo.
II. Mikrochirurgische Verfahren - linksatrialen Ligation
Diese ex-ovo Kultur Setup ist ideal für die Durchführung von chirurgischen Anwendungen zum Hühnerembryonen, da sie volle Zugänglichkeit bietet, um den Embryo. Unten ist das Protokoll für ein Beispiel Technik, linksatrialen Ligation (LAL) (Abbildung 5). Das Verfahren ist etwa 24 Stunden in die Kultur Periode (HH24) durchgeführt:
- Bereiten overhand Knoten ~ 0,5 mm Durchmesser mit 10-0 Nylon chirurgisches Nahtmaterial.
- Mit feinen Pinzetten, lokal entfernen Sie die Chorion-Allantois-und Membranen über den Embryo und heben den Embryo von der Rückseite zu drehen vertikal, so dass die linke Seite des Embryo sichtbar ist.
- Mit feinen Pinzette entfernen Herzbeutel über den linken Vorhof.
- Richten Sie den Knoten in den linken Vorhof und anziehen. Der Knoten sollte so gebunden werden, da ~ 75% des ursprünglichen Blutflusses auf die linke Seite zu verbieten. Schneiden Sie die Kanten des Knotens mit Mikroschere und vorsichtig entfernen und entsorgen Überschuss Naht.
- Drehen Sie den Embryo wieder in seine ursprüngliche Orientierung (rechts oben).
- Sham Kontrollen beinhalten das gleiche Verfahren, aber der Faden wird nur durchfahren werden, und nicht gebunden. Effektive LAL Behandlung (75% Einschnürung) wird nach 24 Stunden nach der Operation bestätigt werden, und disqualifiziert Embryonen ausgeschlossen wird.
Abbildung 5:. A-Steuerung und einen linken Vorhof ligiert Hühnerembryo Pfeil zeigt die linken Vorhof, die etwa 75% kleiner in der ligierten Embryo ist.
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Discussion
Optischer Zugang und Experimentieren in Vogelembryonen ist eine Herausforderung aufgrund von Einschränkungen der Eischale. Windowing deutlich begrenzt die Anzahl der Mikrogefäßen zugänglich für Injektionen und mikrochirurgische Ansätze 8. Als Ergebnis nur frühe Embryonen können manipuliert werden und eine kontinuierliche Beobachtung ist nicht möglich. Frühe ex-ovo Kulturen mit Petrischalen wurden von begrenztem Nutzen, weil unzureichender Kontrolle der Oberflächenspannung auf den Embryo verhindert langfristig Kultur 9. Wir haben vor kurzem verbessert diese Technik mit einem sechseckigen wiegen Boot, das akzeptable Oberfläche tenstion 7. betont, aber diese Kulturen waren schwierig zu transportieren. Die hier vorgestellte Technik löst dieses Problem und erweitert die Art der experimentellen Methoden und bildgebende Verfahren, einschließlich Mikroinjektion und chirurgischen Eingriffen eingesetzt werden kann. Da die Forschung konzentriert sich auf das Verstehen der späteren morphogenic Veranstaltungen wird diese Technik ermöglichen die Überwachung und Regulierung der Entwicklung Ereignisse, die derzeit unmöglich, experimentell kontinuierlich zu studieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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