Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen
Summary
In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um langfristig zu ermöglichen<em> Ex-ovo</em> Vogelembryo Kultur. Diese Technik ist ideal für die Längs-Experimente erfordern komplette optische Zugänglichkeit und / oder sterilen Transport in Vogelembryonen.
Abstract
Das Verständnis der Zusammenhänge zwischen genetischen und Mikroumgebung Faktoren, die normale und fehlerhafte embryonale Entwicklung Laufwerk ist von grundlegender Bedeutung für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien. Fortschritte in der Imaging-Technologie haben die quantitative Untersuchung der Organisation und Reifung des Körpers Plan aktiviert, aber später embryonalen Morphogenese ist weniger klar. Hühnerembryonen sind eine attraktive Wirbeltier-Modellsystem für diese Anwendung wegen seiner Leichtigkeit von Kultur und chirurgische Manipulation. Frühe Embryonen können für eine kurze Zeit auf Filterpapier Ringe, die komplette optische Zugang für die Zell-Strukturierung und Schicksal Studien 1,2 ermöglicht kultiviert werden. Studieren fortgeschrittenen Entwicklungsprozessen, wie Herz-Morphogenese sind traditionell durch ein Fenster der Eischale 3-5 durchgeführt, aber diese Technik Grenzen optischer Zugang durch Fenstergröße. Wir zuvor entwickelte eine einfache Methode zur Kultur ganzen Embryonen ex-ovo auf sechseckigen wiegen Boote für bis zu 10 Tage, die hochauflösende Bildgebung mittels Ultraschall 6,7 aktiviert. Diese Kulturen wurden schwer zu transportieren, wodurch die Arten von Imaging-Tools für Live-Experimente. Wir stellen hier eine verbesserte Shell-less Kultur mit einem kostengünstigen, tragbaren Klimakammer. Die Eier wurden auf einer Hängematte mit einem Polyurethan-Membran (Frischhaltefolie) ringförmig an einem Plastikbecher teilweise mit sterilem Wasser gefüllt angebracht erstellt geknackt. Die Abmessungen des Umfangs und der Tiefe der Hängematte waren beide entscheidend für die Oberflächenspannung zu halten, während die Mechanik der Hängematte und Wasser unter geholfen dämpfen Vibrationen, die durch den Transport induziert. Eine kleine Stellfläche zirkulierenden Wasserbad wurde auch entwickelt, um kontinuierliche Temperaturkontrolle während der Experimente zu ermöglichen. Wir zeigen die Fähigkeit, Kultur Embryonen auf diese Weise für mindestens 14 Tage ohne morphogenic Defekt oder Verzögerung und beschäftigen dieses System in mehreren mikrochirurgischen und Imaging-Anwendungen.
Protocol
Discussion
Optischer Zugang und Experimentieren in Vogelembryonen ist eine Herausforderung aufgrund von Einschränkungen der Eischale. Windowing deutlich begrenzt die Anzahl der Mikrogefäßen zugänglich für Injektionen und mikrochirurgische Ansätze 8. Als Ergebnis nur frühe Embryonen können manipuliert werden und eine kontinuierliche Beobachtung ist nicht möglich. Frühe ex-ovo Kulturen mit Petrischalen wurden von begrenztem Nutzen, weil unzureichender Kontrolle der Oberflächenspannung auf den Embryo ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertile white Leghorn chicken eggs | ||||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | ||||
| Saran Wrap | ||||
| Kimwipes | Kimberly-Clark, Inc. | |||
| Rubber bands | ||||
| Warm sterile water | ||||
| 9 oz plastic cup | ||||
| 100 mm diameter Petri dish | ||||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing CO, Savannah GA | |||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma Aldrich Inc. | |||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | |||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | ||||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Sarasota FL | Model M3301L | ||
| Fluorescent microscopy | Zeiss | Z20 | ||
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Sarasota FL | |||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | |||
| Tubing | VWR | 1mm OD | ||
| 3 mL syringe | BD | |||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR |
References
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