במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח ארוך<em> לשעבר אובו</em> העובר העופות תרבות. טכניקה זו היא אידיאלית עבור ניסויים האורך הדורשים נגישות אופטי מלא ו / או תחבורה סטרילי בעוברים העופות.
Abstract
הבנת יחסי הגומלין בין גורמים גנטיים microenvironmental כי ההתפתחות העוברית כונן רגיל פגום מהותית על גילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות. התקדמויות טכנולוגיית הדמיה אפשרו חקירה כמותית של הארגון והתבגרות של התוכנית הגוף, אבל המורפוגנזה עובריים בשלב מאוחר יותר הוא פחות ברור. עוברי עוף הם בעלי חיים בעלי חוליות אטרקטיבי מודל המערכת עבור יישום זה בגלל קלות של תרבות מניפולציה כירורגית. עוברי מוקדם יכול להיות מתורבת לזמן קצר על טבעות נייר סינון, המאפשר גישה אופטיים המלא ל דפוסים התא מחקרים 1,2 הגורל. לימוד תהליכים התפתחותיים מתקדמות כגון המורפוגנזה לב מבוצעים באופן מסורתי דרך חלון של קליפת 3-5, אבל הטכניקה הזו מגבילה גישה אופטית בשל גודל חלון. אנחנו קודם לכן פיתחו שיטה פשוטה לתרבות עוברים כל לשעבר אובו על סירות לשקול משושה עד 10 ימים, מה שאיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות אולטרסאונד 6,7. תרבויות אלו היו קשים בתחבורה, להגביל את סוגי כלי הדמיה עבור ניסויים לחיות. כאן אנו מציגים שיפור מערכת קרב פחות תרבות עם תא, חסכונית סביבתי נייד. ביצים סדוקות על ערסל נוצר על ידי קרום פוליאוריטן (נצמד) מודבקת circumferentially על כוס פלסטיק מלאה חלקית עם מים סטריליים. מידות ההיקף והעומק של הערסל שניהם קריטי לשמור על מתח הפנים, בעוד המכניקה של הערסל מים מתחת עזר לשכך ויברציות המושרה על ידי התחבורה. טביעת רגל קטנה במחזור אמבט מים פותחה גם כדי לאפשר בקרת טמפרטורה רציף במהלך הניסויים. אנו מדגימים את היכולת עוברי התרבות בדרך זו לפחות במשך 14 ימים ללא פגם morphogenic או עיכוב להעסיק זו מערכת microsurgical מספר יישומי הדמיה.
Protocol
1. Ex-אובו תרבות לפרוטוקול: לדגור ביצים עוף מופרית ביצי תרנגולת מופרות ניתן לאחסן 13 ° C עד 5 ימים לפני הדגירה ללא ייזום ופיתוח. מקרר יין אדום יכול לשמור על טמפר…
Discussion
גישה אופטית ניסויים בעוברים העופות הוא מאתגר בשל אילוצים של קליפת ביצה. Windowing משמעותי מגבילה את מספר microvessels נגיש גישות הזרקת microsurgical 8. כתוצאה מכך רק עוברי מוקדם ניתן להשפיע תצפית רציפה אינו אפשרי. מוקדם לשעבר אובו תרבויות באמצעות צלחות פטרי היו של שימוש מו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Fertile white Leghorn chicken eggs
Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO
Saran Wrap
Kimwipes
Kimberly-Clark, Inc.
Rubber bands
Warm sterile water
9 oz plastic cup
100 mm diameter Petri dish
1602N thermal air
GQF Manufacturing CO, Savannah GA
Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline)
Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154, doi:10.3791/2154 (2010).