Summary
इस अनुच्छेद में, हम सक्षम लंबी अवधि के लिए एक सरल पद्धति मौजूद है
Abstract
आनुवांशिक और microenvironmental कारकों के बीच रिश्तों कि सामान्य और विकृत भ्रूण के विकास ड्राइव को समझना नया चिकित्सात्मक रणनीतियों की खोज के लिए मौलिक है. इमेजिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति को संगठन और शरीर की योजना के परिपक्व के मात्रात्मक जांच सक्षम है, लेकिन बाद में मंच भ्रूण morphogenesis कम स्पष्ट है. चिकन भ्रूण एक आकर्षक संस्कृति और शल्य चिकित्सा हेरफेर के अपने आसानी के कारण हड्डीवाला जानवर इस आवेदन के लिए मॉडल प्रणाली रहे हैं. प्रारंभिक भ्रूण फिल्टर पेपर के छल्ले, जो सेल patterning और भाग्य अध्ययन 1,2 के लिए पूरा ऑप्टिकल का उपयोग सक्षम बनाता है पर एक कम समय के लिए संवर्धित किया जा सकता है है. अध्ययन हृदय morphogenesis जैसे उन्नत विकास की प्रक्रिया पारंपरिक 3-5 eggshell की एक खिड़की के माध्यम से प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन इस तकनीक ऑप्टिकल विंडो का आकार की वजह से उपयोग की सीमा . हम पहले से हेक्सागोनल वजन नावों पर एक सरल पूरे भ्रूण पूर्व ओवो संस्कृति विधि विकसित करने के लिए 10 दिन, जो 6,7 अल्ट्रासोनोग्राफी के माध्यम से उच्च संकल्प इमेजिंग सक्षम के लिए. इन संस्कृतियों के लिए परिवहन के लिए मुश्किल थे, इमेजिंग रहते प्रयोगों के लिए उपलब्ध उपकरणों के प्रकार सीमित है. हम यहाँ एक बेहतर खोल - कम एक लागत प्रभावी, पोर्टेबल पर्यावरण चैम्बर के साथ संस्कृति प्रणाली मौजूद है. अंडे एक polyurethane झिल्ली (लपेटो चिपटना) आंशिक रूप से बाँझ पानी से भरा एक प्लास्टिक कप के लिए circumferentially चिपका के द्वारा बनाई गई झूला पर टूट गया. झूला की परिधि और गहराई के आयामों दोनों सतह के तनाव को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण थे, जबकि झूला और पानी के नीचे की यांत्रिकी मदद परिवहन के द्वारा प्रेरित कंपन गीला हो जाना. एक छोटा सा पानी स्नान परिसंचारी पदचिह्न भी प्रयोग के दौरान लगातार तापमान नियंत्रण सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था. हम कम से कम 14 दिनों के लिए morphogenic दोष के बिना संस्कृति भ्रूण में इस तरह की क्षमता का प्रदर्शन या देरी और कई microsurgical और इमेजिंग अनुप्रयोगों में इस प्रणाली को रोजगार.
Protocol
1. भूतपूर्व ओवो संस्कृति प्रोटोकॉल:
- निषेचित चिकन अंडे सेते
- निषेचित चिकन अंडे 13 पर भंडारित किया जा सकता ° C बिना विकास की शुरुआत ऊष्मायन पहले 5 दिनों के लिए. एक रेड वाइन कूलर इस तापमान को बनाए रखने कर सकते हैं.
- सेते 72 घंटे के लिए कुंद पक्ष अंडे एक 60% 37.5 निरंतर कमाल के साथ निरंतर नमी इनक्यूबेटर ° C में.
- Hammocks (चित्रा 1a) तैयार
- 9 ऑउंस प्लास्टिक कप की ¾ गर्म बाँझ पानी के साथ भरें. एक नियमित रूप से 9 ऑउंस कप 8 सेमी की एक शीर्ष व्यास है. हमने पाया है कि इस आकार के लंबे समय संस्कृति यहाँ प्रस्तुत आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त था.
- के बारे में 20 सेमी कट लपेटो चिपटना. कप के चारों ओर एक रबर बैंड रखकर शीर्ष पर circumferentially प्रत्यय. प्लास्टिक की पानी की चोटी पर फैलाया जाना चाहिए. बैंड के आसपास अतिरिक्त प्लास्टिक कट. हम इस आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त हो सकता है क्योंकि यह जर्दी के आसंजन को रोकता है, परिवहन के दौरान की जर्दी बंटवारे में जिसके परिणामस्वरूप के लिए लपेटो चिपटना पाया.
- Kimwipes (इंक Kimberly-क्लार्क,) 70% इथेनॉल के साथ गीला के साथ प्लास्टिक पोछो.
- ऊष्मायन के 72 घंटे के के बाद इनक्यूबेटर से अंडे निकालें.
- 70% इथेनॉल kimwipes गीला के साथ सतह पोंछते द्वारा अंडे जीवाणुरहित.
- भ्रूण (चित्रा 1b) के उचित स्थिति के लिए 1-2 मिनट के लिए अंडे क्षैतिज लेटाओ. एक अंडा दफ़्ती क्षैतिज अंडे बिछाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भ्रूण 1-2 मिनट के बाद शीर्ष पर बारी बारी से होगा.
- Hammocks पर भ्रूण स्थानांतरण aseptically एक लामिना का प्रवाह हुड में.
- (एक धातु बाल्टी या एक गिलास बीकर के किनारे की तरह) एक तेज धार का प्रयोग, अंडा धीरे नल जब तक अंडे (चित्रा -1 सी) के underside पर एक छोटा सा गड्ढा है. याद रखें, भ्रूण upperside पर तैनात है.
- सेंध के विपरीत दिशा में अंगूठे रखो और गोले के अलावा क्षैतिज खींच (चित्रा 1 दिन).
- भ्रूण के साथ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से albumin झूला (आंकड़ा 1e) पर जर्दी रखें. जर्दी के आसपास albumin dampening वातावरण प्रदान करने के लिए प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से आगे बढ़ के रूप में यह लंबे संस्कृति प्रथाओं के लिए भ्रूण को पोषण प्रदान करता है द्वारा प्रेरित झटके को अवशोषित करेंगे. झूला नीचे जल भ्रूण परिवहन के दौरान समानांतर भूमि पर रहेगी गर्मी की एक कंडक्टर के रूप में में सेवा इमेजिंग के दौरान अगर एक पानी संचलन हीटर प्रयोग किया जाता है सुनिश्चित करेगा.
- भ्रूण पहले से ही शीर्ष पर तैनात किया जाना चाहिए अगर हस्तांतरण ठीक से किया जाता है. यदि नहीं, तो एक unsharp, बाँझ ऑब्जेक्ट (ie. ब्लंट टिप बंद घुमावदार कैंची की) और directionally ऐसी है कि भ्रूण के शीर्ष करने के लिए में rotates दुलार की जर्दी का उपयोग करें.
- भ्रूण मुहर कप के शीर्ष पर एक 10 सेमी व्यास का पेट्री डिश प्लेस.
- प्लेस इनक्यूबेटर सेट में 37.5 कप संस्कृति ° सी. यदि एक पोर्टेबल इनक्यूबेटर में प्रयोग किया जाता है, 1-2 9 ऑउंस कप आसुत जल के साथ भरा रखने ~ में नमी रहता है 60% (चित्रा 1f).
- यदि भ्रूण 7 दिन से परे संवर्धन भ्रूण, कुचल eggshell टुकड़े हड्डी विकास और परिपक्वता के लिए एक कैल्शियम स्रोत के रूप में भ्रूण की परिधि के चारों ओर बिखरे हुए किया जाना चाहिए.
बाहर इमेजिंग इनक्यूबेटर / हेरफेर के लिए गौण यंत्र:
ऊष्मायन तापमान बनाए रखने के एक परिसंचारी पानी के स्नान घर में बनाया गया था जबकि इमेजिंग या हेरफेर (चित्रा 3). एक पानी स्नान है कि कप फिट कर सकते हैं एक पानी जलाशय के लिए उपयुक्त आकार टयूबिंग के माध्यम से जुड़ा हुआ है. एक प्रतिरोध हीटर जो मैन्युअल रूप से पानी के तापमान के बाद से नियंत्रित किया जाता है जलाशय में पानी तपता है. एक पानी पंप पानी circulates. Pictoral प्रतिनिधित्व ultrasongraphy / florescent माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) के माध्यम से इमेजिंग आसानी दर्शाया गया है.
चित्रा 1. झूला और चिकन भ्रूण के hammocks करने के लिए स्थानांतरण की तैयारी.
चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम - अलग चरण चिकन पूर्व ओवो संस्कृति तकनीक के माध्यम से विकसित भ्रूण एचएच 17 के बाद से भ्रूण इस तकनीक के माध्यम से उगाया जा सकता है.
चित्रा 3. पानी परिसंचरण पूर्व ओवो संस्कृति प्रणाली के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया प्रणाली आदर्श विकास के तापमान पर भ्रूण रखने के योजनाबद्ध और प्रतिनिधि चित्रों.
2. चयनित आवेदन:
मैं Microinjection
इस भ्रूण संस्कृति microinjection अनुप्रयोगों जहां समाधान करने के लिए इसके विपरीत आधारित इमेजिंग (ie. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, सूक्ष्म गणना स्थलाकृति आदि) (चित्रा 4) के लिए vasculature इंजेक्शन जा आवश्यकता के लिए उपयुक्त है. नीचे microinjection प्रोटोकॉल है:
- इंजेक्शन appara तैयारदर्जा
- फैशन beveled टिप एक microforge microneedles का उपयोग कर में 0.75 आईडी गिलास केशिका ट्यूब खींच लिया. आवश्यक टिप के आकार के लक्ष्य नस / व्यास प्रवाह वांछित दर पर निर्भर करता है.
- सिरिंज 0.03 इंच आईडी सिलिकॉन टयूबिंग कनेक्ट.
- लोड इंजेक्शन जा समाधान के साथ टयूबिंग और टयूबिंग के लिए microneedle कनेक्ट.
- Micromanipulator और सिरिंज धारक या सिरिंज पंप करने के लिए सिरिंज पर microneedle प्लेस.
- बाँझ पानी कप में जिससे भ्रूण बढ़ा जोड़ें. हम अनुभवी है कि एक रक्त वाहिका (ie. vitelline पोत) में सुई के उचित पैठ के लिए, क्षैतिज प्रवेश आवश्यक है. यह भ्रूण कप के किनारों के रूप में एक ही विमान पर करने की आवश्यकता है है.
- भ्रूण के तहत प्लास्टिक पकड़े रबर बैंड ले लो.
- प्लास्टिक के एक तरफ धीरे लिफ्ट और कप के लिए कुछ बाँझ पानी जोड़ने.
- प्लास्टिक पर रबर बैंड फिर सुरक्षित.
- एक भ्रूण पोत समाधान इंजेक्षन. हमारे अनुभव में, जब एक vitelline पोत समाधान के लिए अंतःक्षिप्त है microneedles पोत व्यास के आकार लगभग 1 / 10 वें खून बह रहा कारण के बिना कुशल छिड़काव बनाए रखने की जरूरत है.
- कोई हवाई बुलबुले के गठन सुनिश्चित करने microneedle समाधान पम्प.
- चयनित पोत पर microneedle की नोक संरेखित करें. Vitelline वाहिकाओं के लिए, एक कांटा के क्षेत्र का चयन अधिकतम पोत घुसना क्षेत्र को दे देंगे.
- पोत की दिशा में सुई पुश. पोत पहली बार वापस लेना होगा. एक बार सुई प्रवेश, छिड़काव शुरू करते हैं. खून बह का रंग छिड़काव के साथ बदलना चाहिए. यदि रंग बदलने के लिए नहीं देखा है, सुई पोत के बाहर penetrated हो सकता है. उस मामले में, धीरे धीरे वापस लेना microneedle जबकि एक साथ समाधान पंप तक पोत में रंग परिवर्तन देखा जाता है. एक बार छिड़काव पूरा हो गया है, पोत के microneedle बाहर वापस लेना.
चित्रा 4: एक पूर्व ओवो सुसंस्कृत लड़की भ्रूण की vasculature में एक फ्लोरोसेंट रंजक के Microinjection.
द्वितीय. Microsurgical प्रक्रिया - बाएं आलिंद Ligation
यह पूर्व ओवो संस्कृति सेटअप लड़की भ्रूण के लिए शल्य चिकित्सा अनुप्रयोगों के प्रदर्शन के बाद से यह भ्रूण के लिए पूर्ण पहुँच प्रदान करता है है के लिए आदर्श है. नीचे के लिए एक उदाहरण तकनीक प्रोटोकॉल है, आलिंद ligation (लाल) (चित्रा 5) छोड़ दिया है. प्रक्रिया लगभग 24 घंटे संस्कृति अवधि (HH24) में किया जाता है:
- तैयार समुद्री मील ओवरहैण्ड ~ 0.5 मिमी व्यास 10-0 नायलॉन शल्य सिवनी का उपयोग.
- ठीक संदंश के साथ, स्थानीय भ्रूण अधिक कोरियोनिक और allantoic झिल्ली को हटा दें और पीछे से भ्रूण को लिफ्ट करने के लिए यह खड़ी जैसे कि भ्रूण के बाईं ओर दिखाई देता है बारी बारी से.
- ठीक संदंश का प्रयोग, बाएं आलिंद पर pericardium हटा दें.
- बाएं आलिंद पर गाँठ संरेखित करें और इसे कस. गाँठ इतनी बंधा होना चाहिए ~ मूल रक्त के प्रवाह को बाईं ओर के 75% के रूप में निषेध के लिए. Microscissors साथ गाँठ के किनारों को काटें और सावधानी से हटाने और अतिरिक्त सीवन त्यागें.
- भ्रूण वापस अपने मूल ओरिएंटेशन (शीर्ष पर दाईं ओर) घुमाएँ.
- शाम नियंत्रण एक ही प्रक्रिया शामिल है लेकिन सीवन बस के माध्यम से पारित कर दिया जाएगा और बंधा नहीं होगा. प्रभावी लाल उपचार (75% कसना) 24 बजे के बाद सर्जरी की पुष्टि हो जाएगा, और निरर्हित भ्रूण को बाहर रखा जाएगा.
चित्रा 5: एक नियंत्रण और एक बाएं आलिंद ligated लड़की भ्रूण तीर छोड़ दिया atria, जो के बारे में 75% ligated भ्रूण में छोटे है दिखाता है.
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Discussion
ऑप्टिकल का उपयोग करने के लिए और एवियन भ्रूण में प्रयोग भंगशील वस्तु की कमी की वजह से चुनौती दे रहा है. Windowing काफी इंजेक्शन और microsurgical 8 दृष्टिकोण के लिए सुलभ microvessels की संख्या की सीमा. केवल एक परिणाम के रूप में जल्दी भ्रूण और चालाकी से किया जा सकता है निरंतर अवलोकन संभव नहीं है. प्रारंभिक पूर्व ओवो पेट्री डिश का उपयोग कर संस्कृतियों सीमित उपयोग के थे भ्रूण पर सतह तनाव का अपर्याप्त नियंत्रण की वजह से लंबी अवधि 9 संस्कृति को रोका. हमने हाल ही में इस तकनीक का उपयोग कर एक हेक्सागोनल नाव वजन है कि स्वीकार्य सतह 7 tenstion रखता है सुधार हुआ है, लेकिन इन संस्कृतियों मुश्किल से परिवहन थे. यहाँ प्रस्तुत की तकनीक इस समस्या का हल है और काफी प्रयोगात्मक विधियों और इमेजिंग तकनीक है कि microinjection और शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं सहित नियोजित किया जा सकता प्रकार फैलता है. बाद morphogenic घटनाओं को समझने के रूप में अनुसंधान पर केंद्रित है, इस तकनीक की निगरानी और विकास की घटनाओं है कि वर्तमान में प्रयोगात्मक लगातार अध्ययन असंभव मॉडुलन सक्षम हो जाएगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
