Summary
En este artículo se presenta una metodología sencilla para que a largo plazo
Abstract
Entender las relaciones entre factores genéticos y microambientales que impulsan el desarrollo embrionario normal y malformaciones es fundamental para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas. Los avances en tecnología de imagen han permitido a la investigación cuantitativa de la organización y la maduración de la estructura corporal, pero la morfogénesis embrionaria en una etapa posterior es menos clara. Embriones de pollo es un animal vertebrado atractivo sistema de modelo para esta aplicación debido a su facilidad de la cultura y la manipulación quirúrgica. Principios de los embriones pueden ser cultivadas por un corto tiempo en los anillos de papel de filtro, que permite el acceso completo óptico de patrones celulares y 1,2 destino estudios. El estudio de procesos avanzados de desarrollo tales como la morfogénesis cardíaca se realiza tradicionalmente a través de una ventana de la cáscara del huevo 3-5, pero esta técnica limita el acceso óptico debido a tamaño de la ventana. Anteriormente hemos desarrollado un método simple para la cultura embriones enteros ex ovo en el hexagonal pesar barcos de hasta 10 días, lo que permitió imágenes de alta resolución a través de la ecografía 6,7. Estos cultivos fueron difíciles de transportar, lo que limita los tipos de herramientas de imágenes disponibles para los experimentos en vivo. Presentamos aquí una mejora de caparazón sistema de cultivo con un costo-efectivo, cámara ambiental portátil. Los huevos estaban rotas en una hamaca, creada por una membrana de poliuretano (film transparente) fijado circunferencialmente a una taza de plástico llena parcialmente con agua estéril. Las dimensiones de la circunferencia y la profundidad de la hamaca fueron fundamentales para mantener la tensión de la superficie, mientras que la mecánica de la hamaca y el agua por debajo ayudado a amortiguar las vibraciones inducidas por el transporte. Un tamaño pequeño baño de agua circulante también fue desarrollado para permitir un control continuo de la temperatura durante la experimentación. Se demuestra la capacidad de cultivar los embriones de esta manera por lo menos 14 días sin defectos o retraso morfogénica y emplear este sistema en varias de microcirugía y aplicaciones de imágenes.
Protocol
1. Ex-ovo Cultura Protocolo:
- Incubar huevos de gallina fertilizados
- Fecundados los huevos de gallina se puede almacenar a 13 ° C hasta 5 días antes de la incubación sin iniciar el desarrollo. Un enfriador de vino tinto puede mantener esta temperatura.
- Incubar los huevos lado romo en un 60% de humedad constante incubadora con la oscilación continua a 37,5 ° C durante 72 horas.
- Preparar hamacas (Figura 1a)
- Llene ¾ de 9 oz vasos de plástico con agua estéril tibia. Un habitual 9 oz taza tiene un diámetro máximo de 8 cm. Hemos encontrado que este tamaño era el más adecuado para su aplicación a largo tiempo en la cultura que aquí se presenta.
- Cortar unos 20 cm de film transparente. Ponga circunferencialmente en la parte superior de la copa mediante la colocación de una banda elástica alrededor. Plástico debe ser esparcida en la superficie del agua. Corte el exceso de plástico alrededor de la banda. Encontramos film transparente, para ser más adecuado para esta aplicación ya que evita la adherencia de la yema de huevo, lo que resulta en la división de la yema durante el transporte.
- Limpie el plástico con Kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) humedecido con etanol al 70%.
- Eliminar los huevos de la incubadora después de 72 horas de incubación.
- Esterilizar los huevos limpiando la superficie con etanol al 70% Kimwipes mojada.
- Poner los huevos en horizontal durante 1-2 minutos para el posicionamiento adecuado del embrión (Figura 1b). Un cartón de huevos se pueden utilizar para poner los huevos en posición horizontal. Los embriones se gire a la cima después de 1-2 minutos.
- La transferencia de embriones en hamacas asépticamente en una campana de flujo laminar.
- El uso de un borde afilado (como el borde de un cubo de metal o un vaso de vidrio), toque suavemente el huevo hasta que haya una pequeña abolladura en la parte inferior del huevo (Figura 1c). Recuerde, el embrión se coloca en el haz.
- Pon los pulgares en los lados opuestos de la abolladura y tire las cáscaras aparte horizontalmente (Figura 1d).
- Coloque la yema de huevo con embrión, así como la albúmina en la hamaca (Figura 1). Albúmina proporcionará un ambiente de amortiguación alrededor de la yema de absorber las crisis inducidas por el sistema en movimiento, así como proporciona la nutrición al embrión para las prácticas de la cultura de largo. Agua por debajo de la hamaca se asegurará de que el embrión se quedará paralelo al suelo durante el transporte y servir como un conductor de calor durante la exposición, si un calentador de circulación del agua se utiliza.
- El embrión ya se debe colocar en la parte superior si la transferencia se realiza correctamente. Si no, utilice un enfoque, objeto estéril (es decir, la punta roma de tijeras curvas cerradas) y acariciar direccionalmente la yema de tal manera que el embrión se gira a la cima.
- Coloque un diámetro de 10 cm placa de Petri en la parte superior de la copa para sellar el embrión.
- Lugar en la Copa cultura en el conjunto de la incubadora a 37,5 ° C. Si una incubadora portátil se utiliza, la colocación de 1 a 2 sept tazas oz con agua destilada mantiene la humedad en el ~ 60% (Figura 1f).
- Si los embriones más allá del día de cultivo embrionario 7 de la cáscara de huevo trituradas piezas deben ser esparcidas alrededor de la periferia del embrión como fuente de calcio para el desarrollo óseo y la maduración.
Equipo auxiliar para los fuera de la incubadora de imagen / manipulación:
Un baño de agua circulante fue construido en casa para mantener las temperaturas de incubación, mientras que la manipulación de imágenes o (Figura 3). Un baño de agua que puede caber la taza está conectada mediante un tubo de tamaño apropiado para un depósito de agua. Un calentador de resistencia calienta el agua en el embalse que se regula manualmente mediante la temperatura del agua. Una bomba de agua hace circular el agua. Representación pictórica muestra la facilidad de imágenes a través de ultrasongraphy / microscopía florescent (Figura 3).
Figura 1. Preparación de la hamaca y la transferencia de embriones de pollo para hamacas.
Figura 2. Los resultados representativos -. Diferentes embriones de pollo etapa crecido a través de la cultura técnica de ex ovo embriones de HH 17 en adelante se pueden cultivar a través de esta técnica.
Figura 3. Imágenes esquemáticas y representante del sistema de circulación de agua que se utiliza en conjunción con el sistema de cultivo ex-ovo para mantener los embriones a la temperatura ideal de desarrollo.
2. Las solicitudes seleccionadas:
I. La microinyección
Este cultivo de embriones es adecuado para aplicaciones donde las soluciones de microinyección que ser inyectado a la vasculatura de contraste de imagen basado en (es decir, la microscopía fluorescente, micro-topografía computarizada, etc) (Figura 4). A continuación se muestra el protocolo de microinyección:
- Preparar la inyección Apparatus
- Moda sacó 0,75 tubos de vidrio ID capilar en microagujas punta biselada con un microforge. Tamaño de la punta requerida depende de la vena blanco diámetro / caudal deseado.
- Conecte la jeringa al tubo de 0.03 pulgadas de silicona ID.
- Cargar el tubo con la solución a inyectar y conectar la microaguja de la tubería.
- Coloque la microaguja en el micromanipulador y una jeringa para soporte de jeringa o bomba de jeringa.
- Añadir agua destilada en el vaso así lograr que el embrión. Hemos experimentado que para la penetración adecuada de la aguja en un vaso sanguíneo (es decir, buques vitelina), la penetración horizontal, es necesario. Esto requiere que el embrión para estar en el mismo plano que los bordes de la copa.
- Saque la cinta de goma de plástico debajo de la celebración de la del embrión.
- Levantar un lado del plástico suave y añadir un poco de agua estéril a la taza.
- Asegure la banda de goma en el plástico nuevo.
- Se inyecta la solución a un buque de embriones. En nuestra experiencia, cuando la solución se inyecta en un vaso vitelino, microagujas necesario ª tamaño aproximadamente 1 / 10 del diámetro del vaso para mantener la perfusión eficaz sin causar sangrado.
- Bomba de la solución a la microaguja garantizar la no formación de burbujas de aire.
- Alinee la punta de la microaguja en el recipiente seleccionado. Para los buques vitelina, la selección de un área tenedor dará área máxima de penetrar en el buque.
- Empuje la aguja hacia el buque. El primer buque se retraerá. Una vez que la aguja penetra, iniciar la perfusión. El color de la sangre que fluye debe cambiar con la perfusión. Si el cambio de color no se ve, la aguja puede haber penetrado de la embarcación. En ese caso, poco a poco retraer el microagujas y al mismo tiempo de bombeo de la solución hasta que el cambio de color en el vaso se ve. Una vez que la perfusión se ha completado, retire la microaguja de la embarcación.
Figura 4: La microinyección de un tinte fluorescente en la vasculatura de un embrión de pollo ex ovo cultivadas.
II. Procedimiento microquirúrgico - Ligadura auricular izquierda
Esta configuración de la cultura ex-ovo es ideal para realizar aplicaciones quirúrgicas de embriones de pollo, ya que proporciona un acceso completo al embrión. A continuación se muestra el protocolo de una técnica de ejemplo, la ligadura de la izquierda auricular (LAL) (Figura 5). El procedimiento se realiza aproximadamente 24 horas en el período de cultivo (HH24):
- Prepare encima de la cabeza nudos ~ 0,5 mm de diámetro con sutura de nylon 10-0 quirúrgica.
- Con unas pinzas finas, localmente eliminar las membranas coriónica y alantoideo sobre el embrión y levantar el embrión de la parte posterior para rotar verticalmente de manera que el lado izquierdo del embrión es visible.
- Con unas pinzas finas, eliminar el pericardio en la aurícula izquierda.
- Alinear el nudo en la aurícula izquierda y apretarlo. El nudo debe estar vinculada con el fin de prohibir el ~ 75% del flujo de sangre original en el lado izquierdo. Cortar los bordes del nudo con micro tijeras y retire con cuidado y deseche el exceso de sutura.
- Gire el embrión de regreso a su orientación original (a la derecha en la parte superior).
- Sham controles supondrá el mismo procedimiento, pero sólo la sutura se pasa a través y no atados. El tratamiento eficaz LAL (75 constricción%) se confirmó a las 24 horas posteriores a la cirugía, y los embriones descalificado será excluido.
Figura 5:. Un control y un auricular izquierda embrión de pollo liga Flecha muestra la aurícula izquierda, que es aproximadamente el 75% más pequeño en el embrión de liga.
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Discussion
Acceso óptico y la experimentación en embriones de aves es un reto debido a las limitaciones de la cáscara del huevo. Ventanas limita de manera significativa el número de acceso para métodos de inyección y de microcirugía 8 microvasos. Como resultado de ello sólo embriones pueden ser manipulados y la observación continua no es posible. Los primeros ex-ovo culturas utilizando placas de Petri eran de uso limitado debido al control inadecuado de la tensión superficial sobre el embrión impedido la cultura a largo plazo 9. Recientemente hemos mejorado esta técnica con un peso hexagonal barco que mantiene tenstion superficie aceptable 7, pero estas culturas eran difíciles de transportar. La técnica que aquí se presenta resuelve este problema y expande significativamente el tipo de métodos experimentales y técnicas de imagen que pueden ser empleadas, incluidos los procedimientos de microinyección y quirúrgicos. Como la investigación se centra en la comprensión de los acontecimientos posteriores morfogénica, esta técnica permitirá el seguimiento y la modulación de los eventos de desarrollo que actualmente se puede estudiar experimentalmente continuamente.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertile white Leghorn chicken eggs | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Saran Wrap | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Rubber bands | |||
| Warm sterile water | |||
| 9 oz plastic cup | |||
| 100 mm diameter Petri dish | |||
| 1602N thermal air | GQF Manufacturing | ||
| Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline) | Sigma-Aldrich | ||
| Microforge | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Glass capillary tubes (0.75 mm ID) | |||
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Fluorescent microscopy | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Fine 55-forceps | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon Inc. | ||
| Tubing | VWR international | 1mm OD | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 200 μL pipetter and pipette tips | VWR international |
References
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