クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

Summary

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。

Abstract

この実験モデルは 、in vivo蛍光顕微鏡で使用して、急性および慢性の、生理学的および病態生理学的血行動態、炎症、代謝状態のときにマウスの軟膜微小循環を評価するために設計されました。閉じた頭蓋ウィンドウは、マウスの左頭頂後頭葉皮質の上に配置されています。地元の微小循環は、エピと蛍光の照明を使用してウィンドウを使ってリアルタイムに記録されており、血管径と赤血球（RBC）速度の測定が実行されます。 RBCの速度は、リアルタイムの相互相関および/または蛍光標識赤血球を用いて測定されます。軟膜血管と血流と血管の漏出の評価に白血球や血小板の付着は、アルブミン- FITCおよび抗CD45 - TXR抗体などの蛍光標識マーカーの助けを借りて作られています。微小循環は、数日間にわたって繰り返して、ビデオを記録することができます。我々は、血液中の深遠な減少をマウスのマラリアberghei ANKAの感染症の経過中に動的な変化に追従する軟膜微小循環を研究し、CMの発現は血管収縮を特徴と微小循環機能不全に関連付けられていることを示すために最初にウィンドウを閉じるの脳生体顕微鏡を用い流れと最終的には血管虚脱。

Protocol

1。開頭術

8〜10週齢のマウスの開頭術では、チタンのバーは、動物の頭部に配置されていないことを除いて、前述の¹として事前に実行する必要があります。慢性頭蓋ウィンドウが注入された後、軟膜微小循環にも数ヶ月の検査を可能にする安定な製剤である。通常、我々は2〜3週間頭蓋窓の移植後に研究を行う。

2。生体顕微鏡検査

1. 開頭後の2〜3週間、体温をチェックしてから、マウスは軽く（誘導は4％、メンテナンスのため1〜2％）イソフルランで麻酔です。光麻酔は、実験手順の間に動物のストレスや不快感を防ぐために使用されます。
2. 動物は、定位固定フレームと慎重に耳のバーを使って安全に頭の上に腹臥位に配置されます。レベルは、右と左のレバーを使用して調整されます。中核体温は、加熱パッドを使用して維持されます。脳マラリアとマウスは低体温を開発しているので、温度設定は、各動物のために調整する必要があります。
3. 頭蓋窓上にカバースリップを静かに綿棒がウィンドウの下に鉱物油と容器のパノラマ画像で湿らせた綿棒でクリーニングされる実体顕微鏡の助けとデジタルカメラ（ニコンCOOLPIX 995、日本）で取得されます。画像は、印刷同定され、日付と血管径と赤血球（RBC）速度の測定のためのマップとして使用されますされています。
4. マウスは、生​​体内顕微鏡ステージ（ライカ-マクベインカスタマイズ、サンディエゴ、CA）に転送されます。一滴の水がよく歯のアクリルで形成されるのを利用して頭蓋ウィンドウ上に配置され、フォーカスが調整されます。測定値は、20X（LUMPFL - WIR、開口数0.6、オリンパス）水浸対物レンズを用いて実施されています。同船舶は、そのベースラインのレベルへの直接の比較は小さなサンプル集団のための、より堅牢な統計を可能に実行できるように続いている。画像はデジタル低光を高速度カメラ（浜松ホトニクスC9300 - 221、日本）、またはビデオデッキのテープに接続された低光のアナログのカメラ（COHU 4815サンディエゴ、カリフォルニア州）（JVC、日本）、タイムスタンプが（縮小映像のビデオを使用してキャプチャされますシステム、ボイヤー、PA）とカラーモ​​ニター（PELCO、クロービス、CA）。テープが適切に記録を開始する前に識別、およびタイムスタンプは、このようなイベントが再コーディングされれるまでの期間を文書化することで、イベントの識別を可能にしています。
5. 船の最初のチェックは準備の質を評価するために作られ、血液はすべての血管に流れている場合。その後、測定しようとする船舶の選択が行われ、それは、異なる直径の細静脈と動脈を（私たちのマウス軟膜の準備で、ほとんどの船が20と80μmの間の範囲）が含まれますと、ウィンドウによって公開されているエリア内の別の場所をカバーする必要があります。細動脈と細静脈は、容易に容器の影響で血流（それが配布や血液を収集するかどうか）の方向をチェックすることによって区別す​​ることができます。我々の研究では、測定は12隻で行われます。測定する各スポットの正確な場所は、軟膜血管系の画像に注釈が付けられます。
6. 各スポットには、血管の直径は、画像のせん断装置（画像せん断、Vistaのエレクトロニクス、サンディエゴ、カリフォルニア州^）2を用いて測定されます。スポットを選択すると、容器の画像が垂直位置に整列されており、反対の極端が並んでいると読書が文書化されるまで、画像は、傾斜が設定されます。この値は、レチクルキャリブレーションステージのマイクロメータ（エドモンドオプティクス社、バーリントン、NJ）を使用して、各特定の倍率のため、以前のキャリブレーションを実行することでマイクロメートルに変換することができます。
7. 各スポットは、赤血球の追跡のために少なくとも30秒間に記録されます。追跡のために、血液のサンプルを採取し、赤血球は、蛍光色素DILを（Molecular Probes社、カールスバッド、カリフォルニア州）カルボシアニンと〜0.4から0.5パーセント³の生体内濃度を得るために尾静脈から注入で標識されています。 、標識のない注入、緑色蛍光タンパク質を発現する原虫berghei ANKA（PBA）（CJジェンシーとAPウォーターズによって堆積PBA - GFP、マラリアの研究とレファレンス試薬リソースセンターMR4、マナサス、バージニア州からの寄付）に感染した動物にセルが必要です。ビデオ画像は、毎秒150フレームで記録されます。この速度は、最大8 mm / sに速度を測定するための1つのビデオフレームにセルのいずれかに6つのイメージを取得するために設定されていますビデオ画像は、アドビプレミア4.0ソフトウェアを使用してパソコンでデジタル化され、各セル画像のXY座標データはSigmaScanプロ4.0ソフトウェア（SPSSシカゴ、イリノイ州^）4を使用^して得られる。セルの位置は、訓練を受けた観察者の眼がどの、セルの中心の位置の良い推定を与えることが示されたことを考えると、画像解析によって手動ではなく、決定される一般的にhはほとんどの細胞の向きのために観察された最大蛍光の位置に対応しています。位置と速度の複数の測定は、各セルに対して行われ、平均赤血球速度を得るために平均化されます。
8. RBCの速度測定がオフラインで実行されるときに、各マウスの総観測時間は、麻酔のcardiodepressiveの影響を最小限に10〜15分を超えることはありません。
9. 血管径と赤血球速度の測定値が利用可能になると、各血管における血流の計算は、式を使用して行うことができます：Q = V Xπ（D / ^2）2、ここで、Q =血流、V = RBC速度とD =血管の直径。
10. これらの手順は、時間をかけて繰り返すことができます。例えば、脳マラリアのマウスモデルでは、我々は、感染の4日目に始まる毎日の測定を行います。各マウスのために毎日得られた値を100％としています0日目との関係（感染前）、で正規化されます。
11. 血管径や血流の測定に加えて、追加の評価は、インスタンスの改善血流の評価と軟膜血管の白血球及び/または血小板のローリングと接着の分析のために、実行することができます。これらの測定は、蛍光標識マーカーの助けを借りて行われます。マラリアの場合には、我々はまた、GFPを発現しPBAの菌株を使用しての手段によって循環または付着寄生虫を検出することができます。
12. 血流評価のために我々はのソリューションを使用してFITC標識（シグマ、セントルイス、ミズーリ50μg/mouse）アルブミン、そして我々はテキサスレッド（TXR）で標識された汎白血球マーカーCD45に対する抗体を使用して軟膜血管への白血球付着を定量化する（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州4μg/mouse）。アルブミン- FITC（2mg/mL）と20μLの抗CD45 - PE抗体（200μg/mL）を混合し、予め温めておいた尾静脈に注入される。この、25μlのためのマウスは、その後15分間循環させることが許可されている漏れの測定値はアルブミン- FITCかかるしかし、もし、すぐにイメージングすることができます。 XF100 - 2（オメガオプティカル、ブラトルバロ、バーモント州）、および抗- CD45 - TXR蛍光（615nm）を終了しています：アルブミン- FITCとGFP（PBA - GFP pRBC）によって放射される緑色蛍光（518nm）を使用し、鮮やかなALPHAキャプチャされます。 XF42：ビビッド標準で捕獲した。
13. 蛍光標識アルブミンが貫通血管を含む血管網の改良可視化を可能にし、それはそのような非灌流または下で灌流血管をチェックするために脳マラリアなどの疾病状態に特に便利です。また、血管漏出^5を測定するために使用することができます。
14. 蛍光標識した抗CD45抗体は、軟膜血管への白血球のローリングと接着を識別し、定量化が容易になります。定量化のバイアスを避けるために、我々は、同じ箇所の血流を測定するために事前定義されたのローリングと接着性を定量化する。白血球付着の定量は、100μmの血管の長さが白血球の数をカウントすることによって行われます。ローリングは、30秒の間に、同じ100μmの長さで血液の速度よりもはるかに遅い速度で走行白血球の数をカウントすることにより定​​量される。

3。代表的な結果

図1。頭蓋窓を介してアクセスできるマウス軟膜血管のネットワークの（ステップ2.6）写真。

図2。マウス軟膜微小循環の生体顕微鏡用に設定されたの（ステップ3.1から3.5）回路図の表示。 1：生体内顕微鏡、2：20倍水浸対物レンズ、3：光源、4A：デジタル低光量、高速カメラ、4B：アナログカメラ、5：定位フレームのマウス、6：コンピュータモニター、7：アナログシアラー画像のせん断（矢印）が血管の直径を測定するために行われる方法を示す監視。

図3。高速蛍光ビデオ録画からの細胞の追跡により（ステップ3.6から3.8）微小血管の赤血球速度測定。 Fまでの画像をカメラで顕微鏡フィールドの区切りを越えて、単一の移動RBCを示すone軟膜血管のシーケンスの画像です。そのプレキャリブレーションの距離で、フィールドを横断する15以上のセルの枠の位置でフレームの手動決定は、Excelスプレッドシートの助けを借りて、各容器内の平均赤血球速度の計算が可能になります。

図4。 マラリア原虫berghei ANKA（PBA）に感染したマウス（n = 5）で、時間の経過と非感染コントロールマウスの軟膜血流の変化を示す代表的な実験の（ステップ3.9）のデータ（N = 5）。対照マウスに軟膜の血流が時間とともに比較的安定であるのに対し、PBA感染マウスは、血流の著しい減少を示す脳マラリアの開発（6日目）の時。データは平均± SEMである。

図5。 （ステップ4.3）などの抗CD45 -テキサスレッド蛍光抗体で染色によって明らかにされたマラリア原虫berghei ANKAに感染したマウスの軟膜血管への接着白血球の数が多い。

Discussion

ここで説明する生体顕微鏡法は、マウスの軟膜微小循環の詳細な観察のためのユニークで強力なツールが用意されています。それは個々の細動脈と細静脈を疎かし、そのような血管径、赤血球の速度、血流、白血球、血小板などの血液の要素の遵守とローリング、血管漏出、組織のpHとPO2のようなパラメータの数の変化を測定し、潜在的に多くのことが可能となりますアプリケーション。 in vivoで血管反応で速やかにそのような薬剤の投与などの介入により評価、または病理学的プロセスの間にすることができます。また、微小循環の振る舞い​​は、動的に時間の経過とともに追跡することができます。我々はP.によって引き起こされる脳マラリアの間に軟膜微小循環の変化を研究するためにこの技術を使用しているbergheiマウスのANKA、そしてこのモデルでは神経学的症候群は脳血流量の減少、血管収縮、障害灌流、最終的には血管虚脱⁶によって特徴付けられる微小循環不全に関連付けられていることが示されている。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865