活体鼠脑微循环显微镜使用一个封闭的颅窗口

Summary

活体显微镜，按照时间和空间在软脑膜微循环血流动力学和炎症事件。

Abstract

这一实验模型的目的是评估在急性和慢性，生理和病理的血 ​​流动力学，炎症和代谢的条件下小鼠软脑膜微循环 ，在体内荧光显微镜使用。左parieto枕的老鼠的大脑皮层放置在一个封闭的颅窗口。通过使用EPI和荧光照明，测量血管直径和红细胞（RBC）的执行速度的窗口局部微循环是实时记录。使用实时交叉相关性和/或荧光标记的红细胞，红细胞流速测量。白细胞和血小板粘附到软脑膜血管灌注和血管渗漏的评估与荧光标记的标记，如白蛋白- FITC和抗CD45 - TxR还抗体帮助。可以反复录像在几天微。我们用于第一次关闭窗口脑活体显微镜研究软脑膜微循环的动态变化，并跟随在安卡疟原虫感染小鼠当然，显示CM的表达与微循环功能障碍的特点是由血管收缩，减少血液中的深刻流，并最终血管崩溃。

Protocol

1。开颅手术

需要提前¹如前所述，除了一个钛棒是不是动物的头放在一个开颅手术在8到10周大的老鼠。慢性颅窗口是一个稳定的准备允许甚至几个月后，被植入的软脑膜微循环检查。通常情况下，我们执行2-3周后颅窗口植入我们的研究。

2。活体显微镜

1. 开颅手术后两三个星期，体温检查，然后鼠标轻轻麻醉与异氟醚（归纳为4％，维持1-2％）。浅麻醉是用来防止动物在实验过程中的压力和不适。
2. 动物俯卧位，然后放置在一个立体的框架，并仔细担保使用耳酒吧头。使用左，右杠杆水平调整。使用电热垫保持核心体温。由于小鼠脑型疟疾的发展低温，温度设定需要调整每个动物。
3. 颅窗口盖玻片，轻轻地用棉签蘸用矿物油和立体显微镜和一台数码相机（尼康Coolpix 995，日本）的帮助下采取的一个窗口下的船只的全景照片，清洗。 ，图像打印，确定并注明日期，并将于血管直径和红细胞（RBC）的速度测量的地图。
4. 鼠标，然后转移到一个活体显微镜阶段（定制徕卡麦克贝恩，加利福尼亚州圣迭戈）。一滴水是利用牙科丙烯酸形成颅窗口，重点是调整。测量是使用20X（LUMPFL“世界投资报告”，数值孔径0.6，奥林巴斯）水浸泡的目的。遵循相同的船只，这样可以允许小样本人群更强大的统计，其基准水平的直接比较。用一个数字低光高速摄像机（滨松C9300 - 221，日本），或低光模拟摄像机（4815 COHU，圣迭戈，CA）连接到录像机的磁带（JVC，日本），时间戳记（显微视频拍摄的图像系统，Boyertown，PA）和彩色显示器（派尔高，克洛维斯，CA）。磁带录制开始前，正确地识别和时间戳允许记载了这样的事件，在此期间，被重新编码的时间内查明事件。
5. 的船只进行检查以评估该制剂的质量，如果血液中流动的所有船只。然后，选择要测量的船只，它应该包括不同直径的静脉和动脉（在我们的小鼠软脑膜的准备，大多数船只20至80μm的范围内），并覆盖窗口暴露的面积内的不同地点。动脉和静脉，可以很容易地通过检查在该船只的后果的血流量（是否分发或收集血液）的方向分化。在我们的研究中，测量在12艘。每次测量现场的确切位置是在软脑膜血管的图片注释。
6. 对于每一个部位，血管直径测量使用图像剪切设备（图像剪切，Vista的电子，圣迭戈^，CA）2。一旦当场被选中时，该船只的形象是一致的垂直位置和图像剪切，直到反对极端对齐和阅读记录。这个值可以被翻译成微米，由先前的校准为每个特定的使用光罩校正阶段微米（埃德蒙光学公司，巴林顿，新泽西州）的放大倍率。
7. 每一个点是在至少30秒红细胞跟踪记录。的血液样本进行跟踪，收集，和红细胞荧光标记的carbocyanine染料DIL（Molecular Probes公司，卡尔斯巴德，CA），并通过尾静脉注入，以获得一个在体内的浓度^约为 0.4-0.5％ 3。在与疟原虫 ANKA（PBA）表达绿色荧光蛋白（捐赠的疟疾研究和参考试剂资源中心，弗吉尼亚州马纳萨斯MR4，PBA - GFP的;由CJ Janse和AP水域沉积）感染的动物，没有输液的标记细胞是必要的。在每秒150帧的视频图像记录。这个比率是获得一至六个月的细胞图像上一个视频帧的速度决心，至8毫米/秒视频图像的数字化与个人使用的Adobe总理4.0软件的计算机，每个细胞图像的XY坐标数据得到使用SigmaScan Pro 4.0的软件（SPSS芝加哥^，IL） 4。细胞职位手动决心，而不是通过图像分析，一个受过训练的观察者的眼睛被证明是一个一个细胞的中心，位置好估计一般h对应的大多数细胞方向观察到的最大荧光的位置。多个位置和速度的确定是为每个单元，平均每场获得平均红细胞速度。
8. 当红细胞流速测量离线执行，每个鼠标的总观测时间不超过10-15分钟，尽量减少麻醉的cardiodepressive效果。
9. 一旦血管直径和RBC的速度测量，计算在每艘船舶的血流量，可以使用公式：Q = V Xπ（D / ^2）2，其中Q =血流量，V =红细胞速度和D =血管直径。
10. 随着时间的推移，这些程序可以重复。例如，在脑型疟疾的小鼠模型，我们进行感染的第4天开始每天测量。获得每天为每个鼠标的值是0天（前感染），这被认为是100％归。
11. 除了血管直径和血流测量，可以进行评估，例如改进的灌注和软脑膜血管中的白细胞和/或血小板滚动和坚持的分析评估。这些测量与荧光标记的标记帮助。疟疾的情况下，我们还可以通过使用PBA菌株，表达GFP的检测循环或附着寄生虫。
12. 对于灌注的评估，我们使用的解决方案FITC -标记的白蛋白（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州50μg/mouse），量化白细胞粘附我们使用对泛白细胞标记与德克萨斯红（TXR）标记CD45抗体的软脑膜血管（ Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA4μg/mouse）。对于这一点，白蛋白FITC（2mg/mL）和抗CD45 - PE抗体20μL（200μg/mL）混合，并在预热尾静脉注射25μL。鼠标就可以立即成像，但是，如果泄漏测量白蛋白FITC标记允许分发了15分钟。使用阿尔法生动：XF100 - 2（欧米茄光，伯瑞特波罗（Brattleboro），VT）和抗CD45 - TXR荧光（615nm）退出和白蛋白- FITC和GFP（PBA - GFP PRBC）发出绿色荧光（518nm）被捕获捕获一个生动的标准：XF42。
13. 荧光标记白蛋白允许改进的血管网络，包括穿透血管的可视化，是有用的，特别是在疾病状态，如脑型疟疾检查非灌注或灌注下的船只。它也可以用来测量血管渗漏^5。
14. 荧光标记的抗CD45抗体可以很容易识别和量化白细胞滚动和软脑膜血管粘连。为了避免在量化的偏见，量化滚动和粘附在预先定义的测量血流量的相同点。白细胞粘附的量化是由白细胞计数100μm的血管长度。滚动量化计算的行驶速度明显高于在同一100μm的长度在30秒，血流速度慢的白细胞数量。

3。代表性的成果

图1。 （步骤2.6）鼠标软脑膜血管网络，通过颅窗口访问的图片。

图2。 （步骤3.1-3.5）示意图显示设置小鼠软脑膜微循环活体显微镜。 1：活体显微镜; 2：20X水浸泡的目标; 3：光源; 4A：数字低光高速摄影机; 4B：模拟摄像机; 5：鼠标在立体定位框架; 6：电脑显示器; 7：模拟采煤机监测显示，图像剪切（箭头）如何做是为了测量血管直径。

图3。 （步骤3.6-3.8）微血管的红血细胞的细胞追踪的速度测量，从高速荧光录像。图片一到F是一个软脑膜血管的序列图像，呈现出一个单一的移动红细胞过路相机微观领域的分隔。手动确定由15个或更多的细胞，过路的领域，其预校准的距离帧帧的立场，允许在每艘船舶平均红细胞速度计算与Excel电子表格的帮助。

图4。 （步骤3.9）一个具有代表性的软脑膜血流量的变化显示在疟原虫 ANKA（PBA）（N = 5）感染小鼠的时间和感染的对照组小鼠在实验数据（N = 5） 。而在对照组小鼠软脑膜血流量相对稳定，随着时间的推移，PBA感染小鼠的血流量明显减少在脑型疟疾的发展（6天）的时间。数据的平均值± SEM。

图5。 （步骤4.3），抗CD45 -得克萨斯州的红色荧光抗体染色显示，大量白细胞粘附感染伯氏疟原虫ANKA鼠标的软脑膜血管。

Discussion

这里描述的活体显微镜方法，提供了一个在小鼠软脑膜微循环的详细观察独特而强大的工具。它允许挑出个别动脉和静脉和测量的一些参数如血管直径，红细胞速度，血流量，坚持和白细胞，血小板和其他血液成分，血管渗漏，组织pH值及PO2滚动的变化和潜在的许多其他应用。 在体内的血管反应，可及时进行评估后，如药品监督管理局的干预，或在病理过程。此外，微循环的行为，可以动态地跟进，随着时间的推移。我们已经利用这种技术研究在脑型疟疾的软脑膜微循环的变化而引起的 P. 疟原虫 ANKA鼠标，并已表明，在此模型中的神经综合征是与脑血流量减少，血管收缩，灌注受损，最终血管^塌陷 6的特点是微循环障碍。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865