Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

Summary

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Abstract

Este modelo experimental fue diseñado para evaluar la microcirculación del ratón pial en aguda y crónica, hemodinámicos fisiológicos y fisiopatológicos, las enfermedades inflamatorias y metabólicas, el uso de microscopía de fluorescencia in vivo. Una ventana craneal cerrado se coloca sobre la izquierda parieto-occipital la corteza de los ratones. Microcirculación local se registra en tiempo real a través de la ventana con epi e iluminación de fluorescencia, y las mediciones de los diámetros de los vasos y de glóbulos rojos (RBC) velocidades se llevan a cabo. RBC velocidad se mide en tiempo real mediante la correlación cruzada y / o hematíes marcadas con fluorescencia. Adhesión de leucocitos y plaquetas a los vasos piales y la evaluación de la perfusión y la permeabilidad vascular se realizan con la ayuda de los marcadores de fluorescencia etiquetados, como los anticuerpos albúmina-FITC y anti-CD45 TxR. Microcirculación pueden ser grabados en vídeo varias veces durante varios días. Se utilizó por primera vez la ventana de microscopía intravital cerca del cerebro para estudiar la microcirculación pial para seguir los cambios dinámicos en el curso de la infección por Plasmodium berghei ANKA en ratones y muestran que la expresión de la CM se asocia con trastornos de la microcirculación se caracteriza por la vasoconstricción, la profunda disminución de la sangre el flujo vascular y eventualmente colapsar.

Protocol

1. Craneotomía

Una craneotomía en ratones de 8 a 10 semanas de edad se debe realizar con antelación como se describió anteriormente ^1, excepto que una barra de titanio no se coloca en la cabeza del animal. La ventana craneal crónica es un examen que permite la preparación estable de la microcirculación pial incluso meses después de ser implantado. Por lo general, realizamos nuestros estudios de 2-3 semanas después de la implantación ventana craneal.

2. Microscopia intravital

1. Dos o tres semanas después de la craneotomía, la temperatura del cuerpo se comprueba y luego el ratón es ligeramente anestesiados con isoflurano (4% para la inducción, 2.1% para el mantenimiento). Ligera anestesia se utiliza para prevenir el estrés del animal y el malestar durante el procedimiento experimental.
2. Los animales se colocan en posición de decúbito prono sobre un marco estereotáxico y la cabeza cuidadosamente asegurados con barras de oído. El nivel se ajusta con la palanca derecha e izquierda. La temperatura corporal se mantiene utilizando una almohadilla caliente. Debido a que los ratones con paludismo cerebral desarrolla hipotermia, los ajustes de temperatura deben ser ajustados para cada animal.
3. La hoja de la cubierta de la ventana del cráneo es ligeramente limpiarse con un algodón humedecido con aceite mineral y una imagen panorámica de los vasos debajo de la ventana se realiza con la ayuda de un microscopio estereoscópico y una cámara digital (Nikon Coolpix 995, Japón). La fotografía se imprime, identificado y fechado, y será utilizado como un mapa de las mediciones del diámetro del vaso y el rojo la velocidad de células sanguíneas (glóbulos rojos).
4. El ratón se transfiere a una platina del microscopio intravital (a la medida de Leica McBain, San Diego, CA). Una gota de agua se coloca en la ventana del cráneo aprovechando la bien formada por el acrílico dental, el enfoque se ajusta. Las mediciones se realizan utilizando un objetivo de inmersión en agua 20 veces (LUMPFL-WIR, apertura numérica de 0,6, Olympus). Los vasos se siguen las mismas por lo que las comparaciones directas de sus niveles de referencia se puede realizar teniendo en cuenta estadísticas más robustas para las poblaciones de la muestra. Las imágenes se capturaron con una cámara digital de baja iluminación de alta velocidad (Hamamatsu C9300-221, Japón), o cámara baja analógica luz (COHU 4815, San Diego, CA) conectado a una cinta de vídeo (JVC, Japón), una marca de tiempo (Video MicroImage sistemas, Boyertown, PA) y un monitor de color (Pelco, Clovis, CA). La cinta se identifica apropiadamente antes de comenzar la grabación, y la marca de tiempo permite la identificación de los acontecimientos mediante la documentación del período de tiempo durante el cual estos eventos fueron recodificados.
5. Un primer cheque de los vasos se hace para evaluar la calidad de la preparación y si la sangre fluye en todos los buques. Entonces, la selección de los vasos que se mide se hace y debe incluir las vénulas y arteriolas de diferentes diámetros (en los preparativos del ratón pial, la mayoría de los barcos oscila entre 20 y 80μm) y cubrir diferentes ubicaciones dentro de la zona expuesta por la ventana. Las arteriolas y vénulas se pueden distinguir fácilmente por el control de la dirección del flujo sanguíneo en las ramificaciones de la nave (si se distribuye o se acumula la sangre). En nuestros estudios, las mediciones se realizan en 12 buques. Ubicación exacta de cada punto a medir está anotado en la imagen de la vasculatura pial.
6. Para cada punto, el diámetro de los vasos se mide utilizando un dispositivo de corte de la imagen (corte de la imagen, Vista Electronics, San Diego, CA) ^2. Una vez que el lugar se selecciona, la imagen de la nave está alineada en posición vertical y la imagen se corta hasta que el extremo opuesto están alineados y la lectura está documentado. Este valor se puede traducir en micrómetros de calibración previa para cada aumento específico utilizando un micrómetro de calibración etapa del retículo (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ).
7. Cada punto se registra durante al menos 30 segundos para el seguimiento de los eritrocitos. Para el seguimiento de una muestra de sangre se recogen, y los eritrocitos son marcados con fluorescencia con el colorante carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) y se infunde a través de la vena de la cola para obtener una concentración in vivo de ~ 0.4-0.5% ^3. En los animales infectados con Plasmodium berghei ANKA (PBA) que expresa la proteína verde fluorescente (GFP PBA-, una donación de la investigación de la malaria y el reactivo de referencia del Centro de Recursos MR4, Manassas, VA; depositados por CJ Janse y Aguas AP), no la infusión de etiquetado celular es necesario. Las imágenes se graban a 150 fotogramas por segundo. Esta tasa se fija para obtener desde una hasta seis imágenes de una célula en un fotograma de vídeo para la determinación de las velocidades de hasta 8 mm / s. Las imágenes de video son digitalizadas con un ordenador personal utilizando el software Adobe Premier 4.0, y los datos de coordenadas xy para cada imagen de células se han obtenido utilizando SigmaScan Pro 4.0 (SPSS Chicago, IL) ^4. Puestos de células se determinan de forma manual en lugar de por análisis de imagen, dado que el ojo de un observador entrenado se muestra para dar una buena estimación de la ubicación del centro de una celda, queh, en general, corresponde a la ubicación de la fluorescencia máxima observada para la mayoría de las orientaciones de la célula. Múltiples determinaciones de posición y velocidad se hacen para cada celda y se promedian para obtener la velocidad media de glóbulos rojos.
8. Cuando las mediciones de la velocidad de RBC se realizan en línea, el tiempo total de observación para cada ratón no sea superior a 10-15 minutos para minimizar los efectos de la anestesia cardiodepressive.
9. Una vez que el diámetro del vaso y las mediciones de la velocidad de RBC están disponibles, el cálculo del flujo de sangre en cada buque puede hacerse mediante la fórmula: Q = V x π (D / ²⁾ 2, donde Q = flujo de la sangre, V = velocidad de glóbulos rojos y D = diámetro de los vasos.
10. Estos procedimientos pueden ser repetidas en el tiempo. Por ejemplo, en el modelo de ratón de malaria cerebral, llevamos a cabo mediciones diarias a partir del día 4 de la infección. Los valores obtenidos cada día para cada ratón se normalizan en relación con el día 0 (pre-infección), que se considera 100%.
11. Además de diámetro de los vasos y las mediciones del flujo sanguíneo, las evaluaciones adicionales se puede realizar, por ejemplo, la evaluación de la mejora de la perfusión y el análisis de los leucocitos de rodadura y / o plaquetas y la adhesión en los vasos pial. Estas mediciones se realizan con la ayuda de marcadores fluorescentes con etiqueta. En el caso de la malaria, también podemos detectar que circulan o parásitos adheridos mediante el uso de la cepa PbA que expresa GFP.
12. Para la evaluación de la perfusión se utiliza una solución de albúmina marcada con FITC (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), y para cuantificar la adhesión de leucocitos a los vasos pial usamos anticuerpos contra el marcador pan-leucocitario CD45 marcado con Texas Red (TxR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Para ello, 25μL de la albúmina-FITC (2mg/ml) y 20μL de los anticuerpos anti-CD45-PE (200μg/mL) se mezclan y se inyectan en la vena de la cola pre-calentado. El ratón se pueden crear imágenes de forma inmediata, sin embargo, si las mediciones de las fugas se llevará a la albúmina-FITC se les permite circular durante 15 minutos. De fluorescencia verde (518nm) emitida por la albúmina-FITC y GFP (PBA-GFP GRI) es capturado con Vivid y ALPHA: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), y anti-CD45 TxR de fluorescencia (615nm) y se sale capturadas con una norma Vivid: XF42.
13. La albúmina marcadas con fluorescencia permite una mejor visualización de la red vascular, incluyendo vasos penetrantes, y es particularmente útil en estados de enfermedad como la malaria cerebral para comprobar si los buques no perfundidos o en perfusión. También se puede utilizar para medir la permeabilidad vascular ^5.
14. El marcado con fluorescencia de anticuerpos anti-CD45 que sea fácil de identificar y cuantificar los leucocitos de rodadura y la adherencia a los buques de pial. Para evitar sesgos en la cuantificación, se cuantifica la rodadura y la adherencia en los mismos lugares pre-definidos para medir el flujo sanguíneo. La cuantificación de la adhesión de los leucocitos se hace contando el número de leucocitos en una longitud de 100μm de los vasos. Rolling se cuantificó contando el número de leucocitos que viajan a una velocidad significativamente más lenta que la velocidad de la sangre en la longitud de 100μm mismo, durante 30 segundos.

3. Los resultados representativos

Figura 1. (Paso 2.6) Fotos de la red vascular del ratón pial accesible a través de la ventana del cráneo.

Figura 2. (Pasos 3.1 a 3.5) Esquema de visualización de la puesta en marcha de microscopía intravital de la microcirculación del ratón pial. 1: microscopio intravital; 2: 20X objetivo de inmersión en agua; 3: fuente de luz; 4a: digital de baja iluminación de alta velocidad de la cámara; 4b: cámara analógica, 5: del ratón en el marco estereotáxico, 6: monitor de la computadora; 7: analógico Shearer monitor que muestra cómo la esquila de la imagen (flecha) se realiza para medir el diámetro del vaso.

Figura 3. (Paso 3.6 a 3.8) microvascular de células rojas de la sangre las mediciones de velocidad mediante el seguimiento de la célula a partir de grabaciones de vídeo de alta velocidad de fluorescencia. Fotos de A a F son imágenes de la secuencia de un barco pial, mostrando una sola RBC en movimiento cruzando el campo delimitado por la cámara microscópica. La medición manual del marco de las posiciones de cuadro de 15 o más células de cruzar el campo, con su distancia pre-calibrado, permite calcular la velocidad media de glóbulos rojos en cada buque con la ayuda de una hoja de cálculo Excel.

Figura 4. (Paso 3.9) Los datos de un experimento representativo que muestra los cambios en el flujo sanguíneo pial en el tiempo de Plasmodium berghei ANKA (PBA), los ratones infectados (n = 5) y en el control de ratones no infectados (n = 5). Mientras que en los ratones de control del flujo de sangre pial es relativamente estable en el tiempo, la PBA ratones infectados muestran una marcada disminución en el flujo sanguíneoen el momento del desarrollo de la malaria cerebral (día 6). Los datos son la media ± SEM.

Figura 5. (Paso 4.3) Un gran número de leucocitos adheridos a los vasos pial de un ratón infectado con Plasmodium berghei ANKA, según lo revelado por tinción con anti-CD45-Texas Red anticuerpos fluorescentes.

Discussion

El método de microscopía intravital aquí descrito proporciona una herramienta única y poderosa para la observación detallada de la microcirculación pial en el ratón. Permite singularizar a las arteriolas y vénulas individuales y medir los cambios de una serie de parámetros tales como los diámetros de vasos, las velocidades de RBC, el flujo sanguíneo, la adherencia y la rodadura de los leucocitos, plaquetas y otros elementos de la sangre, la pérdida vascular, el pH del tejido y la pO2 y muchos otros posibles aplicaciones. La respuesta vascular in vivo pueden ser evaluadas de inmediato a este tipo de intervenciones como la administración del fármaco, o durante los procesos patológicos. Por otra parte, el comportamiento de la microcirculación puede ser seguido de forma dinámica a través del tiempo. Hemos utilizado esta tecnología para estudiar los cambios de la microcirculación pial en la malaria cerebral causada por P. ANKA berghei en el ratón, y han demostrado que el síndrome neurológico en este modelo se asocia con una disfunción de la microcirculación se caracteriza por disminución del flujo sanguíneo cerebral, vasoconstricción, alteración de la perfusión vascular y eventualmente colapsar ^6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865