سوف نقوم شرح كيفية دراسة تأثير طفرة نقطة واحدة على وظيفة قناة أيون.
سوف نقوم شرح كيفية دراسة الآثار الفنية لإدخال طفرة نقطة في قناة أيون. ندرس بروتين G – بوابات البوتاسيوم داخليا تصحيح (المشار إليها باسم GIRK) القنوات ، والتي تعتبر هامة لتنظيم استثارة الخلايا العصبية. هناك أربعة أنواع مختلفة من الثدييات قناة GIRK مفارز (GIRK1 – GIRK4) — ونحن نركز على GIRK2 لأنه يشكل homotetramer. التحفيز من أنواع مختلفة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) ، مثل مستقبلات المسكارينية (M2R) ، ويؤدي الى تفعيل قنوات GIRK. الكحول أيضا تنشيط قنوات مباشرة GIRK. وسوف نبين كيفية تحور one الأحماض الأمينية عن طريق تغيير واحد أو أكثر تحديدا النيوكليوتيدات في [كدنا] للقناة GIRK. سوف تتضخم تحور هذا التسلسل [كدنا] في البكتيريا ، وتنقيته ، وسوف يتم تأكيد وجود طفرة النقطة تسلسل الحمض النووي. وسيتم في transfected cDNAs للقنوات GIRK تحور والبرية من نوع الخلايا الجنينية البشرية في الكلى HEK293T تربيتها في المختبر. أخيرا ، سيتم استخدام خلية كاملة التصحيح ، المشبك الكهربية لدراسة التيارات العيانية البوتاسيوم من خلال القنوات وأعرب ectopically GIRK من النوع البري أو تحور. في هذه التجربة ، وسوف ندرس تأثير طفرة في L257W GIRK2 على تفعيل قنوات M2R والتي تعتمد على الكحول.
موقع الموجه الطفرات هو النهج الكلاسيكي لدراسة بنية وظيفة علاقات القنوات الأيونية. لأنه يقوم على فرضية أن طريق تغيير بقايا تنتقد القناة الايونية ينبغي للمرء أن يكون قادرا على مراقبة التغيرات وضوحا في وظيفة القناة. في المقابل ، يمكن عرض العديد من الطفرات في موقف غير الحرجة دون حدوث اضطرابات كبيرة في وظيفة القناة. عادة ، يتم تحور لأول مرة في المسألة إلى بقايا ألانين ، صغيرة غير القطبية الأحماض الأمينية ، تليها لطفرة التربتوفان ، وهو أكبر من الأحماض الأمينية 2. إذا كانت بقايا المهم وظيفة القناة ، سوف تغير كل من الطفرات نشاط القناة. إذا تحولت بقايا أقل أهمية ، وآثار الطفرة ، وبخاصة للألانين وغالبا ما تكون غير ملحوظة. الطفرات التربتوفان هي أكثر احتمالا للتسبب تغيرات بسبب العراقيل المرتبطة الفراغية حجم التربتوفان. في كثير من الأحيان ، يمكن استخدام هذه المعلومات عندما تفتقد الهيكلية ، طفرة منهجية لألانين أو التريبتوفان في غضون جزء من قناة (تسمى ألانين أو المسح التربتوفان) لتحديد موقع بقايا حرجة. ومن المهم أن نلاحظ أن الحيوانات المستنسخة يمكن إعداد متعددة مع الطفرات نقطة مختلفة في السماح موازية لاختبار مخلفات متعددة ضمن فترة زمنية قصيرة نسبيا. في الآونة الأخيرة ، أصبحت هياكل الكريستال متعددة من القنوات المتاحة 3،4،5. يمكن استخدامها لاقتراح مخلفات الرئيسية المحتملة لفحصها باستخدام النهج الموصوفة في هذا البروتوكول.
وينبغي على قياسات البرية من نوع القناة ترافق دائما قياس قناة متحولة لتكون بمثابة مراقبة إيجابية للتأكد من أن أجريت تجارب ترنسفكأيشن والكهربية بشكل صحيح. الطفرات قد يؤدي إلى نقطة عدم وجود الوظيفية الحالية ، وهي مشابهة للائحة الحالية من النوع البري أو تغيير نشاط القناة. قد تفتقر الحالية قابلة للقياس يكون نتيجة لسوء الاتجار لطي أو تغييرها. في مثل هذه الحالة قد يكون من المفيد معرفة ما إذا كانت القناة يتاجر بشكل صحيح على السطح باستخدام مقايسة biotinylation أو تلطيخ المناعي ضد العلامة خارج الخلية (بدون permeabilization الخلية) للتمييز بين القنوات غير وظيفية في غشاء البلازما وقنوات الاحتفاظ داخل الخلية . وأخيرا ، فإنه من المستحسن أن التحقيق ليس فقط النشاط القاعدي للقناة ولكن أيضا من عواقب الطفرات بشأن تنظيم القناة. ويمكن دراسة آليات مختلفة للتعديل وظيفة قناة تبعا للقناة أيون ذات الاهتمام بما في ذلك تنظيم مجموعة من البروتينات ، PIP2 ، الأيونات ATP التركيز ، والفسفرة (باستخدام التيروزين ، أو السيرين ثريونين الطفرة) ، أو ubiquitination sumoylation (باستخدام الطفرة يسين) وفتاحات أو حاصرات قناة مباشرة.
The authors have nothing to disclose.
وأدلى عملنا بفضل الدعم المالي من صندوق الهبات ماكنايت علم الأعصاب (PAS) ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (R01 DA019022 ؛ PAS) ، وقبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA الدكتوراه زمالة للسلطة الفلسطينية (F31AA017042) من المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول. وزودت متحولة GIRK2 – L257W الدكتور أريال Prafulla.
مضان المجهر ورعايته قدمت تفضلت آلات لايكا.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
Chemicals | Sigma | Varies | ||
Mini Prep Kit | Qiagen | 27104 | ||
Radiacwash | Biodex | 005-100 | ||
Poly-D-lysine hydrobromide | BD Biosciences | CB40210 | Poly-L-lysine can also be used | |
Maxi Prep Kit | Qiagen | 12263 | ||
QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit | Stratagene | 200512-5 | ||
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | ||
Cover slips ˆ… 12 mm | Warner Instruments | CS-12R | ||
Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall | Warner Instruments | G150-3 | ||
Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI3000 B | ||
Electrophysiology | Nikon/ Leica/ Zeiss |
Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence |
||
Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B amplifier | ||
Perfusion system | Warner Instruments | VC-6 Perfusion MM-6 | ||
Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1320 digitizer | ||
Manipulators | Sutter Instruments | Manipulator: MP-85 | ||
Electrode Puller | Narishige | PC10 vertical electrode puller | ||
Isolation Table | Technical Manufacturing Corporation | Air table |