Summary
Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die kan worden gebruikt om C vezels schade te kwantificeren diagnosticeren en patiënten stratificeren met toenemende neuropathische ernst.
Abstract
De nauwkeurige kwantificering van perifere neuropathie is van belang om te definiëren op risicopatiënten, anticiperen op achteruitgang, en beoordelen van nieuwe therapieën. Conventionele methoden te bepalen neurologische tekorten en electrofysiologie en kwantitatieve sensorische tests kwantificeert functionele veranderingen op te sporen neuropathie. Echter, de eerste schade lijkt te zijn aan de kleine vezels en toch deze tests in de eerste plaats te beoordelen grote vezels dysfunctie en hebben een beperkte capaciteit om regeneratie en reparatie aan te tonen. De enige technieken die een rechtstreeks onderzoek van de niet-gemyeliniseerde zenuwvezel schade en herstel mogelijk zijn Sural zenuw biopsie met elektronenmicroscopie en huid-punch biopsie. Echter, beide zijn invasieve procedures en vereisen langdurige laboratorium procedures en aanzienlijke expertise. Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die in-vivo beeldvorming van het hoornvlies zenuwvezels biedt. We hebben aangetoond dat vroege schade aan de zenuwen, die het verlies van intra zenuwvezels vooraf in de huid biopten samen met de gelaagdheid van neuropathische ernst en reparatie na pancreas-transplantatie bij diabetespatiënten. We hebben ook aangetoond schade aan de zenuwen in idiopathische kleine vezels neuropathie en de ziekte van Fabry.
Protocol
Inleiding:
De nauwkeurige kwantificering van perifere neuropathie is van belang om te definiëren op risicopatiënten, anticiperen op achteruitgang, en beoordelen van nieuwe therapieën. Conventionele methoden te bepalen neurologische tekorten en electrofysiologie en kwantitatieve sensorische tests kwantificeert functionele veranderingen op te sporen neuropathie. Echter, de eerste schade lijkt te zijn aan de kleine vezels en toch deze tests in de eerste plaats te beoordelen grote vezels dysfunctie en hebben een beperkte capaciteit om regeneratie en reparatie aan te tonen. De enige technieken die een rechtstreeks onderzoek van de niet-gemyeliniseerde zenuwvezel schade en herstel mogelijk zijn Sural zenuw biopsie met elektronenmicroscopie en huid-punch biopsie. Echter, beide zijn invasieve procedures en vereisen langdurige laboratorium procedures en aanzienlijke expertise. Hoornvlies confocale microscopie is een niet-invasieve klinische techniek die in-vivo beeldvorming van het hoornvlies zenuwvezels biedt.
HRT III-Rostock hoornvlies Module (RCM)
Handleiding van operatie
1. Voorbereiding van de Camera
De eerste stap in het onderzoek gebruik van HST is de voorbereiding van het objectief tip.
- Eerst op het doel buis van de laser scanning camera, zet de breking tot +12 dioptrie en pas vervolgens de camera naar de laagste stand.
- Breng een grote homogene, bel gratis, erwt grootte, drop van Viscotears op de lens tip.
- Verwijder een TomoCap uit de steriele verpakking en monteer het over de lens tip zodanig dat de gel een meniscus tussen het objectief en de dop vormen. Duw hem zo ver mogelijk over de houder. Wees voorzichtig dat u de voorzijde van TomoCap aanraken tijdens de montage.
Figuur 1. Voorbereiding van het objectief tip (top) toe te passen viscotear gel (onder) Toepassing van de TomoCap. - Verplaats de laser scanning camera zo ver naar achteren mogelijk op de camera te monteren.
- De binnenste en buitenste oppervlak van de TomoCap zowel verschijnen als een heldere laser reflectie. De focal plane aanpassing wiel moet worden aangepast tot een heldere reflectie wordt waargenomen, wat aangeeft dat de lens gericht is op de voorkant van de kap. De diepte waarde die in de focus positie display moet nu worden tussen -150 en +150 um um.
- Stel de diepte-instelling op nul.
Figuur 2. Aanpassing van het brandvlak.
2. Voorbereiden van de patiënt
De ogen van zijn verdoofd met behulp van een daling van 0,4% benoxinate hydrochloride, en Viscotears wordt gebruikt op de voorkant van het oog voor smering.
Het onderwerp is comfortabel zit, met de kin op de kin rust en gevraagd hun voorhoofd stevig drukken tegen het voorhoofd bar.
Figuur 3. Voorbereiden van de patiënt
3. Het uitlijnen van de camera
Het maakt het onderzoek makkelijker als je de opdracht de patiënt op de buitenste fixatie licht vast met het oog niet wordt onderzocht. Het compacte formaat van de microscoop hoofd betekent dat het onderwerp contralaterale oog niet is verduisterd, waardoor het gebruik van de afstand doelen.
Figuur 4. Doelstelling lens van het hoornvlies module.
- Plaats de CCD camera zodanig dat de optische as loodrecht op de optische as van de laser scanning camera. De camera moet aan de rechterkant van de patiënt kant bij beeldvorming van de rechter oog en vice versa.
Op deze positie, ziet u de voorzijde van de TomoCap in het midden van de CCD-camera live-beeld. - Verplaats de laser scanning camera op de patiënt tot de patiënt hoornvlies is op een afstand van ongeveer 5 tot 10 mm van de TomoCap, verplaats de laser scanning camera omhoog / omlaag en links / rechts met de zwarte knoppen op de camera monteren tot de TomoCap is gepositioneerd in het centrum van het hoornvlies van de patiënt. In dit stadium kunt u controleren of de rode laser licht is in het centrum van het hoornvlies en voor fijne afstelling, de reflectie van de laserstraal te observeren vanuit het hoornvlies, die zichtbaar is in de CCD-camera beeld. Deze reflectie moet exact plaatsvinden op de voorste paal van het hoornvlies.
Figuur 5. Uitlijning van de laserstraal op de voorste paal van het hoornvlies van de centrale cornea beelden vast te leggen. - Vraag de patiënt om zijn / haar ogen te openen zo breed mogelijk. Verplaats de laser scanning camera langzaam vooruit naar de patiënt tot de TomoCap contacten van de patiënt hoornvlies. Als het nodig ishet corrigeren van de positie van de laser scanning camera, dan beweegt de camera uit de buurt van de patiënt eerst, doe de correctie, dan vooruit weer aan het hoornvlies te contacteren.
Figuur 6. Demonstratie van de dunne gel brug tussen de TomoCap en het hoornvlies. - Minimaal contact tussen de camera en het hoornvlies is genoeg. In een optimale aanpassing, een dunne gel brug tussen de TomoCap en het hoornvlies is zichtbaar op de CCD-camera live-beeld.
Als u op de TomoCap of beweeg het hoornvlies te dicht bij de camera dan zie je de druk op het hoornvlies met een afgeplatte verschijning in het hoornvlies via de CCD-camera live-beeld. Ook in de beelden verkregen een lijn met de druk zal verschijnen, dus niet te veel druk aan het hoornvlies toe te passen. Als het contact tot stand is gebracht, niet bewegen de positie van de headrestto te glijden het hoornvlies op de TomoCap.
Figuur 7 (links) Uiterlijk van een straie vanwege de toepassing van hoge druk op het hoornvlies door de TomoCap;. (Rechts) Een beeld met een normaal uiterlijk zonder overdruk.
4. Het onderzoeken van de patiënt
Na het gezichtsveld is geselecteerd, is de HRT III laser camera is ingeschakeld en het beeld overname venster verschijnt op het scherm. Gebruik de CCD afbeelding om de TomoCap en laser licht op het hoornvlies van de patiënt positie. Onderzoek naar het gebruik van de geselecteerde modus kan dan worden begonnen.
Figuur 8. Beeldinstellingsmenu op de monitor tijdens het maken van beelden.
De wijze van verwerving
In de sectie mode, is een enkel beeld verkregen en opgeslagen iedere keer dat u op de voetschakelaar. Wij gebruiken deze modus voor het vastleggen van beelden van de gehele hoornlaag inclusief laag Bowman's in het centrum van het hoornvlies. En dan na het vastleggen van voldoende aantallen van beelden, kan men proberen de andere modi, inclusief volgorde en volume.
Figuur 9. Scherm met de keuze voor verschillende beeldacquisitie modi.
Met de Sequence scan, kan men een reeks van maximaal 100 beelden te verwerven met een verstelbaar frame rate. U kunt kiezen voor een frame rate van 30 frames en 1 frame per seconde (fps) en op basis van deze modus kun je een film te verwerven met een looptijd van 3 tot 100 seconden.
In volume scannen, schakelt de camera krijgt automatisch een serie van 40 beelden bij opeenvolgende brandpunt vliegtuigen. Een totale diepte van 85 micrometer kunnen worden gescand met de "FOV 400 micrometer" veld lens en de brandpuntsafstand tussen twee opeenvolgende beelden zal ongeveer 2,1 micrometer.
Na een paar scans de focus vlak van lens kan worden aangepast aan de diepte van een hoornvlies cellaag ten opzichte van het hoornvliesoppervlak door te brengen de epitheliale cellaag in beeld en vervolgens te klikken op de knop Herstellen om de diepte in te stellen op 0 te meten.
In het kader van onze huidige studie, krijgen we beelden van de centrale cornea op verschillende diepten. Daarom hebben we niet de scanning laser camera bewegen rond het hoornvlies horizontaal of verticaal, we gaan achteruit en vooruit en afbeeldingen vastleggen van alle diepten van laag Bowman's op hetzelfde punt hoornvlies. De afstand tussen elke afbeelding is ongeveer 1 micrometer; dus als de diepte van Bowman is 10 micrometer, zullen we 10 beelden. Maar voor de uiteindelijke analyse, selecteren we beelden met een afstand van ongeveer 2-3 um tussen hen.
Na het onderzoek voltooid is zet u de camera uit door te klikken op de camera knop in de overname venster. Maak de patiënt zich ervan bewust dat hij of zij niet mag zijn of haar ogen wrijven totdat de plaatselijke verdoving is uitgewerkt. Als voorzorgsmaatregel, wil je misschien een spleetlamp onderzoek van het hoornvlies van de patiënt uit te voeren na het onderzoek.
Haal de TomoCap uit de camera en gooi en dan de microscoop lens met een katoenen schoon wattenstaafje bevochtigd met gedestilleerd water.
5. Het analyseren van een onderzoeksbureau
a. Het selecteren van de frames
Het herzien en analyseren van de bestaande onderzoeken, moet de juiste patiënt record (s) worden geselecteerd in de database venster. Het beeld kijkvenster geeft een overzicht van bestaande hoornvlies examens voor de geselecteerde patiënt. Examens uitgevoerd op verschillende dagen worden opgeslagen in aparte tabbladen te bezoeken. De drie verschillende scan-types worden vertegenwoordigd door drie verschillende pictogrammen in de HRT III hoornvlies bezoek aan het tabblad van de beeldkwaliteit van foto's venster van de Heidelberg Eye Explorer.
Naar overzicht het hoornvlies afbeelding, dubbelklikt u op het juiste imago pictogram en de "Show"-functie opent het volgende venster:
Figuur 10. Weergave van alle gemaakte foto's na het onderzoek.
Figuur 11. Weergave van de geselecteerde afbeelding voorafgaand aan de uitvoer met CCD-camera uitzicht op het oog om de juiste afstemming te tonen.
Tot uitvoer van het juiste beelden voor verdere analyse, klik op "Export" op de werkbalk en selecteer vervolgens de map waarin u de afbeeldingen wilt opslaan.
We verkrijgen en vast te leggen beelden uit alle lagen van het hoornvlies voor elke patiënt, maar als de belangrijkste focus van dit onderzoek is op de layer Bowman en het hoornvlies zenuwen, wordt alleen de beelden van deze laag worden geanalyseerd. Wij selecteren 5-6 frames van laag Bowman's voor elk onderwerp op verschillende diepten van het hoornvlies.
Figuur 12. Weergave van alle lagen hoornvlies van een gezonde onderwerp.
Op gemiddeld 5-6 frames van laag Bowman's in het centrum van het hoornvlies op verschillende diepten worden willekeurig geselecteerd voor kwantitatieve metingen en analyse.
b. Het analyseren van beelden
Voor het analyseren van de opnamen van laag Bowman's van het centrale hoornvlies met HST III, gebruiken wij gespecialiseerde software die is ontwikkeld binnen onze groep met de naam "CCM Image Analysis Tools v 0.6".
Vier belangrijkste parameters voor het hoornvlies zenuwen worden gemeten met deze software:
- Zenuwvezeldichtheid (NFD), die wordt gedefinieerd als het aantal van de belangrijkste zenuwen / frame.
- Zenuw tak dichtheid (NBD) aantal van de belangrijkste branches / frame.
- Zenuwvezel lengte (NFL), dat is de totale lengte van alle zenuwen / frame.
- Zenuwvezel tortuositeit (NFT) van de belangrijkste zenuwen / frame.
Voor het openen van CCM beeld, ga naar het bestand> openen.
- Zodra de afbeelding is geladen, wordt de grootte en het type weergegeven in de beeldinformatie Box op de linker-kant van het Control Panel.
- De standaard schaal wordt weergegeven in de lijn van de te bewerken afbeelding Informatie. Als de schaal is anders, wijzig het aantal in het bewerkingsvenster lijn.
- Om te beginnen met het analyseren van de foto, kies de parameter die u wilt meten van de Metric Box in de top rechts van het bedieningspaneel.
- Het resultaat vak aan de onderkant van de pagina het aantal NFD, is NBD gepresenteerd in werkelijke aantal, NFL in mm en tortuositeit als een tortuositeit Coëfficiënt (TC).
- Maar na het exporteren van de resultaten naar een Excel-sheet, zullen de resultaten worden gepresenteerd in een mum van / mm 2 voor NFD en NBD-en mm / mm 2 voor NFL.
- Voor dit doel na het beëindigen van de metingen klikt u op Toevoegen metingen, ga dan naar Bestand> Opslaan als en open de opgeslagen resultaten met Excel.
Figuur 13. Weergave van het hoornvlies zenuw beeld met tracing in analyse-instrument met "CCM Image Analysis Tool".
6. Representatieve resultaten:
We hebben aangetoond dat een progressieve toe in het hoornvlies zenuwdegeneratie met de toenemende ernst van de diabetische neuropathie een en vroege schade aan de zenuwen in diabetes, die het verlies van intra zenuwvezels in de huid biopten voorafgaat aan 2 samen met de gelaagdheid van neuropathische ernst en reparatie na pancreastransplantatie 3 bij diabetespatiënten. We hebben ook aangetoond schade aan de zenuwen in idiopathische kleine vezels neuropathie 4 en 5 de ziekte van Fabry.
Figuur 14. Cornea confocale microscopie beelden met HST III van de laag van de hoornvlies Bowman's (a) controle worden ten opzichte van (b) Patiënt met neuropathie en ernstige schade aan de zenuwen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Corneale confocale microscopie (CCM) is een niet-invasieve klinische techniek die kan worden gebruikt om vroegtijdig schade aan de zenuwen detecteren en kwantificeren van kleine vezels pathologie in perifere neuropathie met inbegrip van diabetes, de ziekte van Fabry en idiopathische kleine vezels neuropathieën (ISFN). De directe klinische impact van deze techniek betekent een enorme sprong voorwaarts op het vlak van ons vermogen te diagnosticeren, te volgen progressie en beoordelen therapeutische respons bij patiënten met diabetische neuropathie en andere perifere neuropathieën en zal een onmiddellijke impact op de patiënt uitkomsten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Figuren 4 - 6: Met dank aan Heidelberg Techniek
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Juvenile Diabetes Research Foundation International (subsidie 17-2008-1031) en de National Institutes of Health (subsidie 1R01DK077903-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module | Heidelberg Engineering | ||
| CCM image analysis software v0.6 | University of Manchester |
References
- Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy. Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).
- Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy. Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).
- Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy. Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease. Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).
