Summary
Kornea mikroskopisi artan nöropatik şiddeti ile hastaların teşhis ve sınıflandırmaktı C lifi hasarı ölçmek için kullanılan olabilir, non-invaziv klinik bir tekniktir.
Abstract
Periferik nöropati doğru kantifikasyon riskli hastalarda, tanımlamak bozulma tahmin, ve yeni tedavilerin değerlendirilmesi önemlidir. Alışılmış yöntemler, nörolojik defisit ve elektrofizyoloji değerlendirmek ve kantitatif duyusal test nöropati tespit etmek için fonksiyonel değişiklikler rakamlarla. Ancak, ilk hasar küçük lifler ve henüz bu testler öncelikle büyük fiber disfonksiyonu değerlendirmek ve yenilenme ve onarım göstermek için sınırlı bir yeteneği var gibi görünüyor. Miyelinsiz sinir lifi hasarı ve onarım doğrudan incelenmesine olanak sadece teknikleri, elektron mikroskobu ve deri punch biyopsi ile sural sinir biyopsisi. Ancak, her iki invaziv girişimler ve uzun laboratuar prosedürleri ve bir hayli uzmanlık gerektirir. Kornea mikroskopisi kornea sinir lifleri in vivo görüntüleme sağlar, non-invaziv klinik bir tekniktir . Biz erken sinir hasarı, cilt biyopsilerinde nöropatik şiddeti ve diyabetik hastalarda aşağıdaki pankreas nakli onarım tabakalaşma birlikte intraepidermal sinir liflerinin kaybı öncesinde ortaya koymuştur. Biz de idiyopatik küçük lif nöropatisi ve Fabry hastalığı sinir hasarı göstermiştir.
Protocol
Giriş:
Periferik nöropati doğru kantifikasyon riskli hastalarda, tanımlamak bozulma tahmin, ve yeni tedavilerin değerlendirilmesi önemlidir. Alışılmış yöntemler, nörolojik defisit ve elektrofizyoloji değerlendirmek ve kantitatif duyusal test nöropati tespit etmek için fonksiyonel değişiklikler rakamlarla. Ancak, ilk hasar küçük lifler ve henüz bu testler öncelikle büyük fiber disfonksiyonu değerlendirmek ve yenilenme ve onarım göstermek için sınırlı bir yeteneği var gibi görünüyor. Miyelinsiz sinir lifi hasarı ve onarım doğrudan incelenmesine olanak sadece teknikleri, elektron mikroskobu ve deri punch biyopsi ile sural sinir biyopsisi. Ancak, her iki invaziv girişimler ve uzun laboratuar prosedürleri ve bir hayli uzmanlık gerektirir. Kornea mikroskopisi kornea sinir lifleri in vivo görüntüleme sağlar, non-invaziv klinik bir tekniktir .
HRT III-Rostock Kornea Modülü (RCM)
Çalışma El Kitabı
1. Kamera hazırlanması
HRT kullanan sınavında ilk adım objektif lens ucu hazırlanması.
- İlk lazer tarama kameranın objektif tüpü, 12 diyoptriye kırılma ve sonra kamerayı en düşük konuma ayarlayın.
- Büyük bir homojen, kabarcık, lens ucunda Viscotears ölçekli bezelye damla uygulayın.
- Steril kapta bir TomoCap çıkarın ve objektif lens ve kapak arasında bir menisküs jel formları böyle lens ucu üzerine monte. Kadar tutucu üzerinde mümkün olduğu kadar itin. Montaj sırasında TomoCap ön yüzeyi dokunmamaya dikkatli olun.
Şekil 1 TomoCap uygulanması viscotear jel (alt) uygulayarak objektif lens ucu (üst) hazırlanması. - Kadar geriye mümkün lazer tarama kamera kamera monte taşıyın.
- TomoCap iç ve dış yüzeyi, parlak bir lazer yansıması olarak görünür. Odak düzlemli ayar çarkı, parlak bir yansıması objektif kapağının ön içinde odaklı olduğunu belirten görülünceye kadar ayarlanabilir olmalıdır. Odak pozisyon ekranda gösterilen derinliği değeri -150 mikron ve 150 mikron arasında olmalıdır.
- Sıfır derinlik ayarını sıfırlayın.
Şekil 2 odak düzlemli ayarlanması.
2. Hasta hazırlanması
Konusu gözünde bir damla% 0.4 benoxinate hidroklorür kullanarak anestezi ve Viscotears yağlanması için göz önünde kullanılır.
Konu çene ile çene geri kalanında rahat oturan ve kendi alnına alnına çubuğu sıkıca basın istedi.
Şekil 3. Hastanın hazırlanması
3. Kamera hizalama
Hasta muayene olmak değil, göz ile dış fiksasyon ışığı düzeltmek için talimat eğer muayene kolaylaştırır. Mikroskop baş mesafe hedefleri kullanımını sağlayan kompakt boyutu, konu kontralateral göz gizlenmiş olmadığı anlamına gelir.
Şekil 4 Objektif lens kornea modülü.
- Optik eksen lazer tarama kamera optik eksene dik çalıştığı CCD kamera yerleştirin. Hastanın sağ tarafında kamera görüntüleme sağ göz ve tersi olmalıdır.
Bu pozisyonda, CCD kamera ile canlı görüntü merkezinde TomoCap ön yüzeyi göreceksiniz. - TomoCap kadar hastanın kornea TomoCap 5 ila 10 mm bir mesafe olan kadar hastanın doğru lazer tarama kamera hareket ettirin, sonra yukarı / aşağı lazer tarama kamera hareket ve sol / sağ kamera monte siyah düğmeleri kullanarak hastanın kornea merkezinde konumlandırılmış. Bu aşamada kırmızı lazer ışığı kornea merkezinde olup olmadığını kontrol edin ve ince ayarı için, CCD kamera görüntüsü görünür kornea, lazer ışını yansıması gözlemlemek. Bu yansıma korneanın ön kutbu tam olarak gerçekleşmesi gerekir.
Şekil 5, santral kornea görüntü yakalamak için kornea ön kutupta lazer ışını uyumu . - Mümkün olduğunca geniş onun / onun gözü açmak için hasta isteyin. Hasta TomoCap temas edinceye kadar hastanın kornea lazer tarama kamera yavaş yavaş ileri doğru hareket ettirin. Gerekiyorsalazer tarama kamera pozisyonunu düzeltmek için, daha sonra sonra kornea daha ileriye taşımak, düzeltme yapmak uzakta, hastanın ilk kamera taşımak.
Şekil 6 TomoCap ve kornea arasındaki ince jel köprü gösterilmesi. - Kamera ve kornea arasındaki minimal temas yeterlidir. Optimal bir ayar TomoCap ve kornea arasında ince bir jel köprü CCD kamera ile canlı görüntü görünür.
Kameraya çok yakın kornea TomoCap basın veya taşırsanız sonra CCD kamera ile canlı görüntü ile korneada basık bir görünüm ile kornea üzerinde baskı göreceksiniz. Ayrıca bu nedenle kornea için çok fazla baskı uygulamayın, basınç görünür gösteren bir çizgi görüntüler elde etti. Bir kez temas kuruldu, headrestto TomoCap kornea sürgülü önlemek pozisyon hareket etmez.
Şekil 7 (sol) TomoCap kornea üzerinde aşırı basınç uygulanması nedeniyle bir straie görünümü (sağda) bir görüntü aşırı baskısı olmadan normal bir görünüme sahip .
4. Hasta incelenmesi
Görüş alanı seçildikten sonra, HRT III lazer kameraya döndü ve görüntü alımı pencere ekranda görüntülenir. Hastanın kornea TomoCap ve lazer ışık konumuna CCD görüntü kullanın. Seçilen modu kullanarak Sınav sonra başlamış olabilir.
Şekil 8 görüntülerin elde edilmesi sırasında monitör modu görüntüleniyor.
Satın alma modu
Bölüm modunda, tek bir görüntü ayak düğmesine basın her zaman kazanılmış ve saklanır. Biz, Bowman tabakası, korneanın merkezi de dahil olmak üzere tüm kornea tabakası görüntüleri yakalamak için bu modu kullanın. Ve sonra yeterli sayıda görüntü ele geçirdikten sonra, bir sıra ve hacim de dahil olmak üzere diğer modlar deneyebilirsiniz.
Şekil 9, farklı görüntü alımı modları için seçimi ile görüntüler .
Sıra tarama ile, bir ayarlanabilir bir kare hızı ile 100 adete kadar görüntü bir dizi elde edebilirsiniz. 30 kare arasında bir kare hızı ve saniyede 1 kare (fps) ve 3 ila 100 saniye arasında bir süre ile bir film elde etmek için bu modu dayalı seçebilirsiniz.
Hacim tarama modu, kamera, otomatik olarak ardışık odak düzlemleri 40 fotoğraf bir dizi satın aldı. 85 mikron toplam derinliği yaklaşık 2.1 mikron olacaktır "FOV 400 mikron" alanına lens ve iki ardışık görüntüler arasında odak uzaklığı ile taranabilir.
Birkaç taradıktan sonra lensin odak düzlemi, kornea epitel hücre tabakası odak noktası haline getiren ve ardından derinlik değeri 0 olarak ayarlamak için Reset butonu tıklayarak yüzeye göreli bir kornea hücre tabakasının derinliğini ölçmek için değiştirilebilir.
Bugünkü çalışmanın amacı, farklı derinliklerde merkezi kornea görüntüler elde. Bu nedenle kornea çevresinde yatay veya dikey tarama lazer kamera hareket yok, biz sadece ileriye ve geriye doğru hareket ve Bowman tabakasının aynı kornea noktada tüm derinliklerinden görüntüleri yakalayabilir. Her görüntü arasındaki mesafe yaklaşık 1 mikron, bu nedenle, Bowman derinliği 10 mm ise 10 görüntü olacak. Ancak son tahlilde, biz, aralarında yaklaşık olarak 2-3 mikron bir mesafe görüntüleri seçin.
Incelenmesinden sonra satın penceresinde kamera güç düğmesine tıklayarak kamerayı kapatmak tamamlandı. Lokal anestezi kapalı yıpranmış kadar o onun gözleri ovmak gerektiğini hasta farkında olun. Bir önlem olarak, muayene sonrası hastanın kornea bir yarık lamba muayene isteyebilir.
TomoCap kameradan çıkarın ve elden ve daha sonra mikroskop lensi temiz bir pamuklu çubukla distile su ile temizleyin.
5. Sınav Analizi
a. Çerçeveler seçme
Mevcut sınavlar incelemek ve analiz için uygun hasta Kayıt (lar) veritabanı penceresinde seçilmiş olması gerekir. Görüntü izleme penceresi, seçilmiş hasta için mevcut kornea sınavların genel bir bakış sağlar. Sınavlar, farklı günlerde yapılan ayrı ziyareti sekmelerde saklanır. Üç farklı tarama türleri Hei görüntü izleme penceresi HRT III kornea ziyaret sekmesinde üç farklı simgeler tarafından temsil edilirdelberg Göz Explorer.
Kornea görüntü anket için, uygun resim simgesine çift tıklayın ve "Göster" fonksiyonu aşağıdaki pencere açılır:
Şekil 10 inceleme sonrasında tüm çekilen görüntülerin görüntüleyin.
Şekil 11: Seçilen görüntünün doğru uyum göstermek için göz CCD kamera görüntüsü ile ihracat öncesi Ekran .
Daha fazla analiz için uygun bir görüntü vermek için, araç çubuğundaki "Export" tıklatın ve sonra görüntüleri kaydetmek istediğiniz klasörü seçin.
Biz almak ve her hasta için korneanın tüm katmanları görüntüleri yakalayabilir, ancak bu araştırmanın ana odak noktası olarak Bowman tabakası ve kornea sinirleri, bu katmanı sadece görüntüleri analiz edilecektir. Biz her konu için farklı derinliklerde korneanın Bowman tabakası 5-6 kare seçin.
Şekil 12 Ekran sağlıklı bir konu tüm kornea tabakaları.
Bowman tabakası kornea merkezinde farklı derinliklerde ortalama 5-6 kare nicel ölçümler ve analizler için rastgele seçilmiştir.
b. Görüntüleri Analizi
HRT III merkezi korneanın Bowman katman yakalanan görüntüleri analiz etmek için, biz "CCM Görüntü Analiz Araçları v 0.6" adlı grup içinde geliştirilen özel yazılım kullanın.
Korneal sinirler için dört ana parametreler bu yazılım ile ölçülür:
- Sinir lifi yoğunluğu (NFD) ana sinirler / kare sayısı olarak tanımlanır.
- Ana dalları / çerçeve Sinir şube yoğunluğu (NBD) numarası.
- Sinir lif uzunluğu (NFL) tüm sinirler / kare toplam uzunluğu olan.
- Ana sinirler / çerçeve sinir lifi kıvrımlarında (NFT).
CCM görüntüyü açmak için, dosya> açık.
- Görüntü yüklendikten sonra, Denetim Masası'ndaki sol üst tarafında Görüntü Bilgi Kutusu, boyutu ve türü görüntülenir.
- Varsayılan ölçekli görüntü Bilgi düzenleme doğrultusunda görüntülenir. Ölçek farklı ise, düzenleme hat numarasını değiştirmek.
- Görüntü analiz başlatmak için kontrol panelinin sağ üst tarafta Metrik Kutusu ölçmek için istediğiniz parametreyi seçin.
- Sayfa sayısı NFD altındaki sonuç kutusuna UHY kıvrımlarında katsayısı (TC) mm ve kıvrımlarında gerçek sayı, NFL sunulmaktadır.
- Ancak sonuçları bir excel sayfasına verdikten sonra, sonuçlar NFD ve UHY ve mm / mm 2 NFL için hayır / mm 2 olacak.
- Bu amaçla ölçümleri Ekle ölçümleri tıklayın bitirdikten sonra, daha sonra Dosya> Excel ile kaydedilen sonuçları açın Save as.
Şekil 13 kornea sinir görüntü analiz aracı kullanarak "CCM Görüntü Analiz Aracı" izleme Ekran.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Biz göstermiştir ilerleyici bir kornea sinir dejenerasyonu diyabetik nöropati 1 ve diyabetik hastalarda pankreas nakli 3 nöropatik şiddeti ve onarım tabakalaşma ile birlikte 2 cilt biyopsilerinde intraepidermal sinir lifleri kaybı önce diyabetin erken sinir hasarı artan şiddeti ile artmaktadır. Ayrıca sinir hasarı idiyopatik küçük lif nöropatisi 4 ve Fabry hastalığı 5 göstermiştir.
Şekil 14 kornea Bowman tabakasının HRT III (b) Hasta nöropati ve şiddetli sinir hasarı ile karşılaştırıldığında (a) Kontrol konu ile kornea konfokal mikroskobu görüntüleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kornea konfokal mikroskobu (CCM), erken sinir hasarı tespit ve periferal nöropati, şeker hastalığı, Fabry hastalığı ve idiyopatik küçük elyaf nöropatiler (ISFN) de dahil olmak üzere küçük lif patoloji ölçmek için kullanılan bir non-invaziv klinik bir tekniktir. Bu tekniğin acil klinik etkisi, teşhis, takip ilerlemesi ve değerlendirmek, diyabetik nöropati ve diğer periferik nöropatiler olan hastalarda terapötik yanıt ve hasta sonuçları üzerinde hemen bir etkisi olacak yeteneği açısından büyük bir atılım temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Şekil 4 - 6: Heidelberg Engineering izniyle
Acknowledgments
Bu çalışma Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (hibe 17-2008-1031) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe 1R01DK077903-01A1) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module | Heidelberg Engineering | ||
| CCM image analysis software v0.6 | University of Manchester |
References
- Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy. Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).
- Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy. Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).
- Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy. Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease. Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).
