Microscopie confocale cornéenne: A Novel technique non invasive pour quantifier Fibre petites pathologie dans les neuropathies périphériques

Summary

Cornée microscopie confocale est une technique non invasive cliniques qui peuvent être utilisés pour quantifier les dommages des fibres C de diagnostiquer et de stratifier les patients avec une gravité croissante neuropathique.

Abstract

La quantification précise de la neuropathie périphérique est important de définir les patients à risque, d'anticiper la dégradation, et d'évaluer de nouvelles thérapies. Les méthodes conventionnelles d'évaluer les déficits neurologiques et l'électrophysiologie et de tests sensoriels quantitatifs quantifie altérations fonctionnelles pour détecter la neuropathie. Cependant, les premiers dégâts semble être de petites fibres et pourtant ces tests avant d'évaluer le dysfonctionnement des fibres grandes et ont une capacité limitée pour démontrer la régénération et la réparation. Les seules techniques qui permettent un examen direct des lésions nerveuses amyéliniques de fibres et de réparation sont une biopsie du nerf sural avec la microscopie électronique et de la peau-biopsie. Toutefois, les deux sont des procédures invasives et nécessitent de longues procédures de laboratoire et l'expertise considérable. Cornée microscopie confocale est une technique non invasive qui permet cliniques en imagerie in vivo des fibres nerveuses cornéennes. Nous avons démontré au début des lésions nerveuses, qui précède la perte des fibres nerveuses intra-épidermique dans les biopsies cutanées avec une stratification de la gravité neuropathique et greffe de pancréas après réparation chez les patients diabétiques. Nous avons également démontré des lésions nerveuses dans la neuropathie idiopathique fibre petites et la maladie de Fabry.

Protocol

Introduction:

La quantification précise de la neuropathie périphérique est important de définir les patients à risque, d'anticiper la dégradation, et d'évaluer de nouvelles thérapies. Les méthodes conventionnelles d'évaluer les déficits neurologiques et l'électrophysiologie et de tests sensoriels quantitatifs quantifie altérations fonctionnelles pour détecter la neuropathie. Cependant, les premiers dégâts semble être de petites fibres et pourtant ces tests avant d'évaluer le dysfonctionnement des fibres grandes et ont une capacité limitée pour démontrer la régénération et la réparation. Les seules techniques qui permettent un examen direct des lésions nerveuses amyéliniques de fibres et de réparation sont une biopsie du nerf sural avec la microscopie électronique et de la peau-biopsie. Toutefois, les deux sont des procédures invasives et nécessitent de longues procédures de laboratoire et l'expertise considérable. Cornée microscopie confocale est une technique non invasive qui permet cliniques en imagerie in vivo des fibres nerveuses cornéennes.

HRT III-Rostock module cornéen (MRC)

Manuel de l'opération

1. Préparation de la caméra

L'étape initiale de l'examen en utilisant THS est la préparation de la pointe objectif.

1. D'abord au niveau du tube objectif de la caméra à balayage laser, réglez la réfraction de 12 dioptries et ensuite ajuster la caméra à la position la plus basse.
2. Appliquez une grande homogénéité, sans bulle, chute de petit pois, des Viscotears sur le bout de l'objectif.
3. Supprimer un TomoCap de son récipient stérile et montez sur la pointe optique tel que le gel se forme un ménisque entre l'objectif et le bouchon. Poussez aussi loin que possible sur le support. Soyez prudent de ne pas toucher la surface avant du TomoCap lors du montage.
   
   Figure 1. Préparation de la pointe objectif (en haut) en appliquant un gel viscotear (en bas) Application de la TomoCap.
4. Déplacez la caméra à balayage laser aussi loin que possible vers l'arrière sur le support de caméra.
5. La surface intérieure et extérieure de la TomoCap apparaissent tous deux comme un reflet laser brillant. La roue plan focal ajustement devrait être ajustée jusqu'à un reflet lumineux est observée, indiquant que la lentille est centrée dans le devant de la casquette. La valeur de la profondeur affichée à l'écran la position accent doit désormais être comprise entre -150 et +150 um um.
6. Réinitialiser le réglage de la profondeur à zéro.
   
   Figure 2. Réglage du plan focal.

2. Préparation du patient

Les yeux du sujet sont anesthésiés en utilisant une goutte de chlorhydrate benoxinate 0,4%, et Viscotears est utilisé sur le devant de l'œil pour la lubrification.
Le sujet est assis confortablement, avec le menton sur la mentonnière et a demandé à la presse leur front fermement contre la barre le front.

Figure 3. Préparation du patient

3. Alignement de la caméra

Il rend l'examen plus facile si vous demandez au patient de fixer sur la lumière de fixation externe avec l'œil non examiné. La taille compacte de la tête de microscope signifie que l'oeil controlatéral sujet n'est pas obscurci, permettant l'utilisation de cibles à distance.

Figure 4. Lentilles Objectif du module cornéen.

1. Position de la caméra CCD de telle sorte que son axe optique est perpendiculaire à l'axe optique de la caméra à balayage laser. La caméra doit être sur le côté droit du patient lorsque l'imagerie de l'oeil droit et vice versa.
   À cette position, vous devriez voir la surface avant de la TomoCap dans le centre de l'image CCD de caméra en direct.
2. Déplacez la caméra à balayage laser vers le patient jusqu'à ce que la cornée du patient est à une distance d'environ 5 à 10 mm de la TomoCap, puis déplacer la caméra à balayage laser haut / bas et gauche / droite en utilisant les boutons noirs sur la monture de la caméra jusqu'à ce que le TomoCap est positionné au centre de la cornée du patient. A ce stade, vous pouvez vérifier que la lumière laser rouge est au centre de la cornée et de réglage fin, observer la réflexion du faisceau laser de la cornée, ce qui est visible dans l'image de la caméra CCD. Cette réflexion doit se faire exactement au pôle antérieur de la cornée.
   
   Figure 5. Alignement du faisceau laser sur le pôle antérieur de la cornée pour capturer des images centrale cornée.
3. Demandez au patient d'ouvrir l'oeil de son / sa aussi large que possible. Déplacez la caméra à balayage laser lentement en avant vers le patient jusqu'à ce que les contacts TomoCap du patient cornée. S'il est nécessairepour corriger la position de la caméra à balayage laser, puis déplacez la caméra loin de la première patiente, ne la correction, puis déplacez-le vers l'avant à nouveau contact avec la cornée.
   
   Figure 6. Démonstration du pont gel mince entre le TomoCap et la cornée.
4. Contact minimal entre la caméra et la cornée est suffisante. Dans un ajustement optimal, un pont entre le gel mince TomoCap et la cornée est visible sur l'image CCD de caméra en direct.

Si vous appuyez sur la TomoCap ou déplacer la cornée trop près de la caméra alors vous verrez la pression sur la cornée avec un aspect aplati de la cornée par l'intermédiaire de l'image CCD de caméra en direct. Toujours dans les images obtenues une ligne indiquant la pression va apparaître, ne s'appliquent donc pas trop de pression à la cornée. Une fois le contact a été établi, ne pas déplacer la position de la headrestto éviter un glissement de la cornée sur le TomoCap.

Figure 7 (à gauche) Apparition d'une straie raison de l'application d'une pression excessive sur la cornée par le TomoCap;. (À droite) Une image avec un aspect normal, sans excès de pression.

4. Examinant le patient

Après le champ de vision a été sélectionné, le HRT III laser caméra est allumée et la fenêtre d'acquisition d'image apparaît sur l'écran. Utiliser l'image CCD à la position du TomoCap et de la lumière laser sur la cornée du patient. Examen en utilisant le mode sélectionné peut alors être engagée.

Figure 8. Regarde un mode de sur le moniteur lors de l'acquisition d'images.

Le mode d'acquisition

Dans le mode de la section, une seule image est acquise et enregistrée chaque fois que vous appuyez sur le commutateur au pied. Nous utilisons ce mode pour capturer des images de la couche cornée entière, y compris la couche de Bowman dans le centre de la cornée. Et puis après la capture d'images en nombre suffisant, on peut essayer les autres modes, y compris la séquence et le volume.

Figure 9. Affichage avec choix pour les différents modes d'acquisition d'image.

Avec la numérisation de séquences, on peut acquérir une séquence de 100 images avec une cadence réglable. Vous pouvez choisir une cadence de 30 images et une image par seconde (fps) et basé sur ce mode, il vous permet d'acquérir un film d'une durée de 3 à 100 secondes.

En mode de balayage du volume, la caméra acquiert automatiquement une série de 40 images à consécutives plans focaux. Une profondeur totale de 85 um peuvent être scannées avec le «FOV 400 um" lentille de champ et la distance focale entre deux images consécutives sera d'environ 2,1 um.

Après quelques scans du plan focal de la lentille peut être modifiée pour mesurer la profondeur d'une couche de cellules de la cornée par rapport à la surface de la cornée en apportant la couche de cellules épithéliales dans le foyer et puis en cliquant sur le bouton Réinitialiser pour définir la valeur de la profondeur à 0.

Pour les besoins de notre présente étude, on obtient des images de la cornée centrale à différentes profondeurs. C'est pourquoi nous ne déplacer la caméra à balayage laser autour de la cornée horizontalement ou verticalement, nous venons de passer d'avant en arrière et de capturer des images de toutes les profondeurs de la couche de Bowman au même point de cornée. La distance entre chaque image est d'environ 1 um; donc si la profondeur de Bowman est de 10 um, nous aurons 10 images. Cependant pour l'analyse finale, nous avons sélectionner les images à une distance d'environ 2-3 um entre eux.

Après l'examen est terminé éteignez l'appareil photo en cliquant sur le bouton d'alimentation caméra dans la fenêtre d'acquisition. Faire le patient conscient qu'il ou elle ne doit pas se frotter les yeux de son jusqu'à ce que l'anesthésie locale a disparu. Par précaution, vous pouvez effectuer un examen à la lampe à fente de la cornée du patient après l'examen.

Retirez le TomoCap de la caméra et jetez puis nettoyer la lentille de microscope avec un coton-tige imbibé d'eau distillée.

5. Analyse d'un examen

a. Sélection des cadres

Pour examiner et analyser les examens actuels, le dossier du patient approprié (s) doit être sélectionné dans la fenêtre base de données. La fenêtre de visualisation d'images donne un aperçu des examens cornée existants pour le patient sélectionné. Examens effectués à des jours différents sont stockés dans des onglets séparés visite. Les trois types de scan différents sont représentés par trois différentes icônes dans l'onglet HRT III visite cornée de la fenêtre de visualisation des images de l'Heidelberg Eye Explorer.

Pour l'enquête de l'image cornée, double-cliquez sur l'icône image appropriée et le "Show" ouvre la fenêtre suivante:

Figure 10. Affichage de toutes les images capturées après examen.

Figure 11. Affichage de l'image sélectionnée avant l'exportation avec une vue caméra CCD d'oeil pour montrer un alignement correct.

Pour exporter les images appropriées pour une analyse ultérieure, cliquez sur "Exporter" sur la barre d'outils, puis sélectionnez le dossier dans lequel vous souhaitez enregistrer les images pour.

Nous obtenons et capturer des images de toutes les couches de la cornée pour chaque patient, mais comme l'objectif principal de cette recherche est sur la couche de Bowman et les nerfs de la cornée, seules les images de cette couche sera analysée. Nous sélectionnons 5-6 cadres de la couche de Bowman pour chaque sujet à différentes profondeurs de la cornée.

Figure 12. Affichage de toutes les couches de cornée à partir d'un sujet sain.

En moyenne 5-6 cadres de la couche de Bowman dans le centre de la cornée à des profondeurs différentes sont sélectionnées au hasard pour des mesures quantitatives et d'analyse.

b. L'analyse des images

Pour analyser les images capturées par la couche de Bowman de la cornée centrale avec HRT III, nous utilisons un logiciel spécialisé qui a été développé au sein de notre groupe appelé «CCM Image Analysis Tools v 0.6".

Quatre paramètres principaux pour les nerfs cornéens sont mesurées avec ce logiciel:

• La densité des fibres nerveuses (DNF) qui est défini comme le nombre de nerfs principaux / châssis.
• Branche de la densité nerveuse (NBD) le nombre de branches principales / châssis.
• Longueur des fibres nerveuses (NFL) qui est la longueur totale de tous les nerfs / châssis.
• Tortuosité des fibres nerveuses (NFT) des principaux nerfs / châssis.

Pour ouvrir l'image du CCM, allez sur le fichier> ouvrir.

• Une fois que l'image est chargée, sa taille et son type est affiché dans la boîte d'information d'image sur le dessus main-côté gauche du panneau de configuration.
• L'échelle par défaut est affichée dans la ligne d'édition de l'information image. Si l'échelle est différente, modifiez le nombre dans la ligne d'édition.
• Pour commencer à analyser l'image, sélectionnez le paramètre que vous voulez mesurer à partir de la boîte métriques dans le haut à droite du panneau de contrôle.
• Dans la boîte de résultat au bas de la page le nombre de DNF, NBD est présenté en nombre réel, la NFL en mm et la tortuosité comme un coefficient de tortuosité (TC).
• Cependant, après l'exportation des résultats vers une feuille Excel, les résultats seront présentés en aucun / mm ² pour DNF et de NBD et mm / mm ² pour la NFL.
• A cet effet, après avoir terminé les mesures de cliquer sur des mesures sur Ajouter, puis allez dans Fichier> Enregistrer sous, puis ouvrez les résultats enregistrés avec Excel.

Figure 13. Affichage de l'image de nerfs de la cornée avec le traçage dans l'outil d'analyse en utilisant «l'outil d'analyse d'images CCM».

6. Les résultats représentatifs:

Nous avons démontré une augmentation progressive de la dégénérescence des nerfs de la cornée avec une gravité croissante de la neuropathie diabétique ¹ et les lésions nerveuses en début de diabète, qui précède la perte des fibres nerveuses intra-épidermique dans les biopsies cutanées ² avec une stratification de la gravité neuropathique et de réparation suivants du pancréas greffe ³ chez les patients diabétiques. Nous avons également démontré des lésions nerveuses dans la neuropathie idiopathique petites fibres ⁴ et la maladie de Fabry ^5.

Figure 14. Cornée images de microscopie confocale au THS III de la couche cornée de la Bowman (a) sous réserve de contrôle par rapport à (b) des patients atteints de neuropathie et de lésions nerveuses graves.

Discussion

Microscopie confocale cornéenne (CCM) est une technique non invasive cliniques qui peuvent être utilisées pour détecter les lésions nerveuses au début et à quantifier petite fibre de pathologie dans les neuropathies périphériques incluant le diabète, la maladie de Fabry et idiopathique neuropathies petites fibres (ISFN). L'impact immédiat clinique de cette technique représente un énorme bond en avant en termes de notre capacité à diagnostiquer, à suivre la progression et évaluer la réponse thérapeutique chez les patients atteints de neuropathie diabétique et d'autres neuropathies périphériques et aura un impact immédiat sur les résultats des patients.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HRT III CCM Machine - The Rostock Cornea Module			Heidelberg Engineering
CCM image analysis software v0.6			University of Manchester