Summary
Una volta che un gene è identificato come potenzialmente refrattaria per il virus della dengue, deve essere valutato per il suo ruolo nella prevenzione delle infezioni virali all'interno della zanzara. Questo protocollo illustra come il grado di dengue di zanzare possono essere analizzati. Le tecniche per crescere il virus in coltura, l'alimentazione a membrana zanzare sangue umano, e saggio titoli virale nel midgut zanzara sono dimostrati.
Abstract
Lo scopo di questa procedura è per infettare la zanzara Aedes con il virus della dengue in una condizione di laboratorio ed esaminare il livello di infezione e dinamica del virus nei tessuti zanzara. Questo protocollo è utilizzato di routine per lo studio delle interazioni virus zanzare, in particolare per l'identificazione dei fattori dell'ospite romanzo che sono in grado di determinare la competenza vettoriale. L'intero esperimento deve essere condotto in un laboratorio BSL2. Simile a infezioni Plasmodium falciparum, abbigliamento adeguato compresi i guanti e camice da laboratorio devono essere indossati in ogni momento. Dopo l'esperimento, tutti i materiali che è venuto a contatto con il virus devono essere trattati con il 75% di etanolo e sbiancato prima di procedere con il normale lavaggio. Tutti gli altri materiali devono essere sterilizzati in autoclave prima di eliminarli.
Protocol
A. Propagare il virus nella linea C6/36 cellulare.
- Cellule crescono al 80% confluenza in 75 cm 2 fiasco;
- Rimuovere il supporto con 3-4 ml resta nel pallone;
- Prendere 0,5 ml di virus magazzino e aggiungere nella cella sopra con la molteplicità di infezione di 1,5 particelle virali per cella. Agitando lentamente per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare per 45 minuti al 5% di CO 2 e 37 ° C
- Aggiungere 30 ml di mezzi di comunicazione, e incubare per 5 giorni.
B. Preparare la miscela di virus e sangue
- Staccare la cella con il raschietto e trasferire la cellula e dei media per il 50 ml provette coniche;
- Centrifugato a 800g per 10 minuti; raccogliere il surnatante, ma lascia 1 ml di surnatante con il pellet di cellule;
- Fermo quanto sopra pellet a secco di CO 2 e poi scongelare in acqua a 37 ° C bagno, ripetere due o tre volte;
- Centrifugato a 800g per 10 minuti, prendere il surnatante, e si combinano con il supernatante viene raccolto dal punto 3;
- Raccogliere il sangue umano intero con la stessa procedura (fase 3) per la preparazione della cultura gametocyte di infettare zanzara Anopheles con Plasmodium falciparum;
- Coniugare la quantità uguale di quanto sopra sangue intero umano con supernatante virus dal punto 4, e aggiungere siero umano (10% del volume totale).
- Incubare la miscela di sopra del sangue umano e virus dengue per 30 minuti a 37 ° C acqua bagno
C. Alimentazione zanzare
Questa procedura è quasi identico a quello che sono stati descritti nella sezione per le infezioni Plasmodium falciparum in zanzare. Noi saggio l'infezione midgut al giorno 7, e l'infezione salivari al giorno 14, dopo il sangue al seno. Tutto il materiale che è venuto a contatto con il virus sono trattati prima con il 75% etanolo e poi con il 10% di candeggina.
D. analisi il titolo del virus nel tessuto zanzara
- Due o tre giorni prima della dissezione dei tessuti zanzara, crescere C6/36 cella di un piatto ben 24 in modo tale che la cellula raggiungere l'80% confluenza nel giorno in cui il saggio è condotto;
- Le zanzare sono anestetizzati a 4 ° C, sacrificato e superficie sterile, mettetelo a bagno nel 75% di etanolo per 1 minuto. Poi le zanzare sono stati lavati con acqua sterile due volte prima di dissezione della ghiandola salivare midgut o sotto il microscopio da dissezione. Da questo passaggio, tutti la seguente procedura deve essere condotta in un ambiente sterile come una cappa di sicurezza biologica. Questi tessuti vengono trasferiti in una provetta contenente 150 microlitri dei media e omogeneizzato con un pestello pellet Kontes motore per 90 secondi;
- Fai una diluizione 1:100 aggiungendo 10 l di dell'omogeneizzato in 990 microlitri dei media;
- Compiere ulteriori 1: 10, 1:100 e 1:1000 diluizione con il mezzo della piastra 96 pozzetti;
- Rimuovere il supporto nella piastra ben 24, e aggiungere 100 ml di ciascuno dei suddetti quattro diluizioni in ogni pozzetto corrispondente;
- Agitare la piastra lentamente per 15 minuti a temperatura ambiente, poi incubare per 45 minuti al 5% di CO 2 e 37 ° C;
- Aggiungere 1ml di methycellulose sovrapposizione (1%) in ogni pozzetto;
- Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 5 giorni;
- I passi da qui in poi non richiedono un ambiente sterile, ma come con qualsiasi altro patogeno cura dovrebbe essere presa in qualsiasi momento. Gettare sovrapposizione methycellulose da ogni piatto e asciugare per rimuovere i supporti in eccesso
- Aggiungere 1 ml di metanolo / acetone fissativo (1:1) in ciascun pozzetto. Conservare a 4 ° C per 1 ora;
- Eliminare il fissativo, e lavare una volta con PBS 1X;
- Fai la diluizione 1:1000 per l'anticorpo primario contro il virus con il 5% Blotto;
- Aggiungere 200 ml di liquido diluito iperimmuni in ogni pozzetto, incubare a 37 ° C per 1 ora;
- Rimuovere il liquido iperimmuni e piastra lavare con 1 X PBS
- Preparare una diluizione 1:1000 di capra anti-topo coniugato (Cat KPL # 074-1806) nel 5% Blotto (latte scremato in polvere 5 g in 100 ml di 1 X PBS), quindi aggiungere 200 microlitri di ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 1 ora;
- Preparare substrato come segue: aggiungere 1 compressa di 3'-diaminobenzidina terrahydrochloride (Cat Sigma # D5905) in 20 ml di PBS 1 X, dopo sciolto, e poi aggiungere 8 ml di perossidasi di idrogeno al 30%
- Aggiungere 200 l di sopra del substrato in ogni pozzetto. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 10 minuti
- Rimuovere il substrato e fermare la reazione con l'aggiunta di 1 ml di acqua distillata in ogni pozzetto
- Eliminare l'acqua e asciugare le piastre ad asciugare
- Contare le particelle del virus
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
| 50 ml conical tubes | plastic | |||
| human serum and blood | O+ | |||
| pipette tip | for tissue culture | |||
| pipettman | ||||
| Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
| water bath | 37C | |||
| centrifuge | ||||
| parafilm | ||||
| circulating water bath | ||||
| glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
| mosquito cups | ||||
| 75% ethanol | ||||
| 10% bleach | ||||
| Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
| Petri dish | glass | |||
| Slides | ||||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | 1X, sterile | |||
| dissecting microscope | Microscope | |||
| C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
| C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
| 3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
| 30% hydrogen peroxidase | ||||
| A. aegypti | Animal | mosquito |
