Summary
ويمكن تقييم الاتجار الجزيئات بين الخلايا النباتية بالإعراب عابر بروتين fluorescently الموسومة المصالح وتحليل توزيعه داخل وبين الخلايا بواسطة المجهر مبائر.
Abstract
هنا ، نطرح على بروتوكول بسيط وسريع لكشف وتقييم مدى الخلية الى خلية النقل الجزيئات في بلانتا. في هذا البروتوكول ، وأعرب عن عابر a fluorescently الموسومة البروتين من الاهتمام في الأنسجة النباتية بعد الولادة biolistic من الحمض النووي لبناء الترميز. ثم يتم تحليل التوزيع داخل وبين الخلايا من البروتين الموسومة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. وصفنا هذه التكنولوجيا بالتفصيل ، وتوفير خطوة بخطوة لبروتوكولات الفحص وتقييم مدى النقل بروتين متحد الجبلة في الأنواع النباتية ثلاثة thaliana Arabidopsis ، ونيكوتيانا benthamiana N. تبغ (التبغ).
Protocol
خلفية
متحد الجبلة النقل الجزيئات من خلال الاتصالات بين الخلايا النباتية ، ورابطات هيولية ، هو موضع اهتمام العديد من الأطباء وعلماء الأحياء النباتية. على سبيل المثال ، لا يعرف العديد من البروتينات الفيروسية لتنظيم plasmodesmal حدود حجم الاستبعاد لتمكين الحركة الفيروسية 1-3. كذلك ، يفترض بعض البروتينات المحلية ، ومن بينها منظمات تنموية هامة ، للانتقال من خلية إلى أخرى ، ويفترض من خلال رابطات هيولية ، إلى وظيفة غير خلية مستقلة 4. وهكذا ، منهجية يمكن الاعتماد عليها لتحديد ووضع تصور لنقل الجزيئات بين الخلايا النباتية بكثير في الطلب.
1) زراعة النباتات المستهدفة
لكفاءة عالية التحول ، يجب استخدام صحي ، ومحطات قوية.
النباتات Arabidopsis 1.
تنمو في مصنع واحد Arabidopsis الموالية للBX ميكس في وعاء (10 سم x 10 سم x 10 سم) في غرفة البيئة التي تسيطر عليها مع الإضاءة قصيرة (8 ساعات من ضوء 130-150 م -2 -1 μE s في 23 ° C/16 ساعة مظلمة عند 20 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 40-65 ٪ لمدة 6 إلى 8 أسابيع 5. تسميد منهم أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا كما هو موضح 5. ويتم اختيار الأوراق مع حجم أكبر من 15 ملم × 35 ملم (قياس طول يشمل سويقات) للتجارب.
2. ن. benthamiana ونون تبغ
تنمو في مصنع واحد الموالية للBX ميكس في وعاء (20 سم x 20 سم x 20 سم) في غرفة البيئة التي تسيطر عليها مع الإضاءة الطويلة (16 ساعة من 130-150 متر μE -2 -1 ضوء s في 23 درجة مئوية 8 / ساعة مظلمة عند 20 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 40-65 ٪ لمدة 7 إلى 10 أسابيع. تسميد منهم أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا باسم وصفها. يترك مع حجم أكبر من 50 ملم 70 ملم x لN. benthamiana أو 100 ملم x 125 ملم لN. تبغ (هذه القياسات لا تشمل طول سويقات) هي المحدد للتجارب.
2) إعداد جين خرطوشة بندقية مع الحمض النووي الذهب المطلي المجهرية الدقيقة
وقد وصفت في بروتوكول لهذه الخطوة التجريبية بالتفصيل سابقا 6. من المهم جدا لاستخدام الحمض النووي البلازميد المنقى جيدا في تركيزات عالية (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على أعلى كفاءة التحويل لسهولة التحليل المجهري مبائر خلال مراحل لاحقة من التجربة.
لهذا الاختبار ، فمن المهم التأكد من أن لا أعد خرطوشة تحويل اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة في نفس الوقت في التردد العالي ، لأنه يتم استخدام عدد من الخلايا ربط مع كتلة إشارة الفلورسنت كمؤشر لمدى النقل متحد الجبلة (أي ، خلية واحدة تحتوي على أي إشارة إلى حركة ، في حين أن كتلة حركة يشير إشارة multicell). يمكن التحقق من جودة كل خرطوشة من خلال تحليل التعبير عن بروتين 16-20 قصف آخر ساعة. بروتوكول لدينا 6 خراطيش تنتج مجموعات التعبير التي تدر multicell فقط في 3 ٪ <لجميع الأحداث التعبير في هذا الإطار الزمني ، وبالتالي مناسبة لهذه التجربة.
3) تسليم Biolistic من الحمض النووي المغلفة المجهرية الدقيقة
- إزالة أوراق المرحلة التنموية نفسها (أي مع نفس الحجم ونفس الفئة العمرية ، راجع الخطوة 1) مع شفرة حلاقة حادة والمكان على الفور مع الجانبين مجافي المحور مواجهة على سطح مستو الستايروفوم. مجافي المحور الجانب من ورقة يمثل الركيزة أفضل للقصف بسبب كثافته أقل شعري الشكل وأرق بشرة. ينبغي تغطية يترك Arabidopsis ، وذلك بسبب صغر حجمها نسبيا ، مع قطعة من شبكة نافذة الشاشة ، وشبكة المضمون ثم مع pushpins إلى السطح الستايروفوم. الحفاظ على أوراق شقة يزيد من كفاءة توصيل الجسيمات ، ويقلل من الأضرار التي لحقت الأنسجة أثناء microbombardment.
- إدراج خرطوشة مع الحمض النووي المغلفة المجهرية الدقيقة (المعد في الخطوة 1) في البندقية. لArabidopsis ، يتم تنفيذ إطلاق النار على ضغوط من 80-110 رطل ل1 ميكرون المجهرية الدقيقة ، و140-160 رطل عن 0.6 ميكرومتر المجهرية الدقيقة. لN. benthamiana والتبغ ، ويتم تنفيذ إطلاق النار على ضغوط من 100-120 رطل ل1 ميكرون المجهرية الدقيقة ، و160-180 رطل عن 0.6 ميكرومتر المجهرية الدقيقة. لArabidopsis ، فإننا عادة ما تستخدم خرطوشة واحدة لكل ورقة ، لأن كل ورقة لديها ما يكفي فقط لمساحة طلقة واحدة المجهرية الدقيقة التي تنتشر على مساحة من 10-12 ملم في القطر. مع أكبر N. benthamiana وأوراق التبغ ، والقصف متعددة من ورقة نفس ممكنة ، ومع ذلك ، لا بد من القيام به في مواقف متماثلة على كل جانب من منتصف الضلع لاستهداف المناطق ورقة في هذه المرحلة التنموية نفسها (انظر مناقشة).
- إزالة الأوراق من على سطح الأرض ووضعها الستايروفوم طليس طبق بيتري على 3 طبقات من ورق الترشيح Whatman الرطب ، وختم طبق بيتري مع Parafilm ، واحتضان ذلك في درجة حرارة الغرفة ل36-48 ساعة للسماح للتعبير عن الجينات المحورة وتسليمها المحتملة الخلية الى خلية حركة المنتجات البروتين .
4) التصوير التعبير البروتين
إشارة من البروتينات الفلورية أعرب عابر المفتاحية هي التي تصور المجهري متحد البؤر. وينبغي الحرص على إيجاد أفضل الإعدادات المجهري للكشف عن البروتين في كل اختبار. على سبيل المثال ، والبروتينات داخل الخلايا التي تظهر تراكم محدودة مع شدة إشارة ضعيفة ، مثل توطين plasmodesmal من البروتين فسيفساء التبغ حركة فيروس (TMV MP) 1-3،6 يراعى تحت عدسة الهدف 40X ، مما يتيح دقة أعلى و الحساسية ، في حين يمكن أن البروتينات التي تظهر توزيع هيولي مع شدة إشارة قوية ، مثل YFP الحرة ، يمكن تصور تحت عدسة الهدف 10X مع وظيفة التكبير والتصغير مبائر لسرعة التصوير (انظر الشكل 1).
يستدل متحد الجبلة النقل من ظهور كتل multicell التي تحتوي على إشارة الفلورسنت. عدد الكتل وعدد من مثل هذه الخلايا في كل مجموعة مما يدل على مدى الخلية الى خلية النقل. للحصول على بيانات موثوق بها ، يجب أن تسجل مجموعات التعبير لا يقل عن 100 في كل نظام التجريبية. على سبيل المثال ، يجب أن تسجل إذا قورن حركة الخلية الى خلية من البروتين في الخلفيات two الجينية المختلفة (على سبيل المثال ، اكتب البرية والنباتات المعدلة وراثيا) ، من مجموع كتل التعبير 200. الأهم ، والتجارب ، ينبغي القيام نتائج التي يمكن مقارنتها مع بعضها البعض ، في وقت واحد.
5. ممثل النتائج
الشكل أدناه يوضح التجارب ممثل للكشف عن النقل متحد الجبلة من البروتينات الموسومة fluorescently. لوحات ألف وباء عرض الصور النمطية التي يتم الحصول عليها مبائر microbombardment التالية من N. benthamiana نبات مع TMV MP - YFP - معربا عن بناء. في لوحة ويلاحظ وجود الحركة ، ومتحد الجبلة من YFP النائب TMV استنادا إلى ظهور كتل multicell الإشارة YFP. ليس كل TMV أعرب عابر MP - YFP غير قادرة على التحرك كما يدل على ذلك إشارة وحيدة الخلية في بعض microbombardments (لوحة باء). إحصائيا ، في <40 ٪ من التجمعات اشارة عدها ، TMV MP - YFP غير قادر على التنقل بين الخلايا في حين أنه في> 60 ٪ للمجموعات ، وينتقل البروتين بين 2-5 خلايا ، مع انتشار الخلايا اثنين كونها الأكثر شيوعا (حوالي 50 ٪ من الحالات ~) (الشكل 1C).
يمكن للبروتينات مع حجم الجزيئات الصغيرة نسبيا دون حركة النشاط الفطري المنتشر من خلال التطوير المهني للانتقال من خلية إلى خلية. على سبيل المثال ، YFP مجانا أو 1xYFP (حوالي 27 كيلو دالتون ، لوحة D) ، وينتشر بين عدة خلايا في 30 ٪ من المجموعات تحسب (لوحات C). هذا الانتشار غير محددة لا يحدث عن باهتة YFP متعدية ، أو 2xYFP (54 كيلو دالتون ، E لوحة) ، والذي يماثل في الحجم لبروتين TMV الانصهار MP - YFP (57 كيلو دالتون) ، والذي هو حكم ذاتي كامل الخلية (الشكل 1C).
الشكل 1. النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها من مقايسة النقل متحد الجبلة في N. benthamiana أنسجة نبات. (A ، B) من التصور TMV MP - YFP. (C) الكميات من كتل الإشارة. و1xYFP 2xYFP ، حرر YFP ومتعدية YFP ديمر ، على التوالي. (د) من 1xYFP التصور. (E) من 2xYFP التصور. في micrographs ، لوحات اليسار تظهر إشارة YFP والحق لوحات تظهر الصور المدمجة من YFP (باللون الأخضر) ، وتألق ذاتي بلاستيدات الخضراء (بيضاء) الاشارات. الصور هي أقسام مبائر واحد. النجمية في micrographs تظهر خلايا البشرة تظهر YFP الإشارة. قضبان = 50 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المفتاح لنجاح تجربة النقل متحد الجبلة هو الحصول على كفاءة عالية التحول ، الذي يسمح للإنتاج مجموعات إشارة ذات دلالة إحصائية واكتشافها بسهولة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام أوراق تحصد من النباتات وصحية قوية ، وإعداد جزيئات الذهب المطلي بواسطة الحمض النووي إعداد نقية ومركزة.
استخدام الأوراق في مرحلة النمو ذاته هو أمر حيوي أيضا لفحص مدى موثوقية. ومن المعروف Plasmodesmal الفتحة إلى أن ينظم بشكل مختلف ، اعتمادا على مرحلة تنموية من النسيج 7-11. يترك العديد من الأنواع النباتية تطوير basipetally ، من قمة إلى القاعدة ، مع الجزء القمي من ورقة يكون أكثر نضجا من جانبها القاعدية 12. وبالتالي ، ينبغي أن لا يقتصر على مرحلة تنموية من الأوراق (التي عادة ما تعكس حجمها وموقعها على الجذعية) المحدد لكل مجموعة من التجارب تكون متطابقة ، ولكن يجب أن يكون موجودا في المناطق التي تستهدفها أوراق microbombardment في مواقف مماثلة.
استخدمت بعض الدراسات السابقة الخلية ذاتي علامات ، مثل الشبكة الهيولية الباطنة - المربوطة GFP (erGFP) 11 ، للتمييز بين الخلايا تحولت في البداية من تلك التي اختبرت هذا البروتين قد انتقل عن طريق النقل متحد الجبلة. ومع ذلك ، أظهرت دراسة في وقت لاحق هذا التعبير في نفس الوقت من بعض البروتينات غير المتمتعة بالحكم الذاتي مع الخلية erGFP تستحث فيها الخلية الى خلية حركة 13 ، والتشكيك في مصداقية erGFP كعلامات التحول الأولية وزيادة كبيرة في صعوبة في تفسير البيانات من coexpression تجارب من هذا القبيل. وبالتالي ، فإننا نفضل تجنب إدخال التعبير عن بروتين آخر في مقايسة حركتنا ، وبدلا من ذلك ، تعتمد على التحليل الإحصائي لأرقام الكتلة الإشارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم عملنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS ، جبهة الخلاص الوطني ، وزارة الزراعة / NIFA وBARD إلى VC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
