Summary
הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.
Abstract
כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוטה ומהירה כדי לזהות ולהעריך את מידת התא אל התא תחבורה מולקולארית Planta. בפרוטוקול זה, fluorescently מתויג חלבון עניין מתבטא transiently ברקמות הצמח לאחר הלידה biolistic קידוד של ה-DNA שלה לבנות. הפצה התוך ואת אינטר של החלבון מתויג הוא ניתח מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו בפירוט, מתן צעד אחר צעד הפרוטוקולים assay ולהעריך את היקף התחבורה חלבון symplastic בשלושה מיני צמחים, thaliana ארבידופסיס, ניקוטיאנה benthamiana ונ tabacum (טבק).
Protocol
רקע
תחבורה Symplastic של מקרומולקולות דרך קשרים צמח אינטר, plasmodesmata, הוא עניין פתולוגים צמחים ביולוגים רבים. לדוגמה, חלבונים נגיפיים כמה ידועים להסדיר plasmodesmal הדרה מגבלות גודל לאפשר תנועה ויראלי 1-3. כמו כן, כמה חלבונים אנדוגניים, ביניהם הרגולטורים התפתחותי חשוב, הם הניחו לעבור מתא לתא, ככל הנראה באמצעות plasmodesmata, לתפקד ללא תאים עצמאי 4. לפיכך, מתודולוגיה אמין לזהות לדמיין תחבורה macromolecular בין בתאי צמח מבוקש מאוד.
1) לגדל את הצמחים היעד
לקבלת יעילות הטרנספורמציה גבוה, בריא, צמחים חזקים אמור לשמש.
1. ארבידופסיס צמחים
לגדול אחד צמח ארבידופסיס על Pro-BX מערבבים בסיר (10 ס"מ X 10 ס"מ X 10 ס"מ) בתא סביבה מבוקרת עם photoperiod קצר (8 שעות של אור μE 130-150 מ 's -2 -1 ב 23 ° C/16 hr כהה 20 ° C) ו 40-65% לחות יחסית במשך 6 עד 8 שבועות 5. לדשן אותם מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרית כמתואר 5. עלים עם גודל גדול יותר מאשר 15 מ"מ x 35 מ"מ (מדידת אורך כולל פטוטרת) נבחרו הניסויים.
2. נ benthamiana ונ tabacum
לגדול אחד צמח ב Pro-BX מערבבים בסיר (20 ס"מ X 20 ס"מ X 20 ס"מ) בתא סביבה מבוקרת עם photoperiod ארוך (16 שעות של 130-150 μE אור מ -2 -1 s ב 23 ° C / 8 שעות חושך על 20 ° C) ו 40-65% לחות יחסית במשך 7 עד 10 שבועות. לדשן אותם מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרית כמו לתאר. עלים עם מ"מ גודל גדול יותר מאשר 50 מ"מ x 70 עבור נ benthamiana, או 100 מ"מ x 125 מ"מ נ tabacum (מדידות אלה אורך אינם כוללים פטוטרת) נבחרו הניסויים.
2) הכנת דיו Gene Gun עם ה-DNA מצופה זהב microparticles
הפרוטוקול של שלב זה ניסיוני תוארה בפירוט בעבר 6. חשוב מאוד להשתמש DNA פלסמיד מטוהרים היטב בריכוזים גבוהים (~ 1 מיקרוגרם / μl) כדי להשיג את יעילות השינוי הגבוה ביותר להקל על ניתוח מיקרוסקופיה confocal בשלבים מאוחרים יותר של הניסוי.
עבור assay זה, חשוב לוודא כי המחסנית אינה מוכנה להפוך שניים או יותר תאים סמוכים בעת ובעונה אחת בתדירות גבוהה, כי המספרים של תאים להתרועע עם מקבץ אות ניאון משמש כאינדיקטור של היקף התחבורה symplastic (כלומר , תא יחיד המכיל את האות מציין שאין תנועה, ואילו מקבץ אות multicell מציין תנועה). האיכות של כל מחסנית ניתן לבדוק על ידי ניתוח ביטוי הפגזה 16-20 חלבון שלאחר שעות. פרוטוקול שלנו 6 מייצרת מחסניות כי התשואה אשכולות multicell ביטוי רק 3% <כל אירועי ביטוי במסגרת הזמן הזה, ולכן מתאים לניסוי זה.
3) משלוח Biolistic של DNA מצופה microparticles
- הסר את העלים של השלב ההתפתחותי אותו (כלומר עם אותו גודל וגיל אותו, ראה שלב 1) עם סכין גילוח חד ומיד למקם אותם עם הצדדים abaxial פונה כלפי מעלה על גבי משטח קלקר שטוחה. הצד abaxial של העלה מהווה מצע טוב יותר עבור הפגזה בשל צפיפות נמוכה שלה trichome ו לציפורן רזה. עלים ארבידופסיס, בגלל גודלו הקטן יחסית שלהם, צריך להיות מכוסה בחתיכת רשת המסך חלון, רשת מאובטחת אז עם נעצים על פני השטח קלקר. שמירה על עלים שטוחים מגדיל את היעילות של משלוח החלקיקים ממזער את הנזק לרקמות במהלך microbombardment.
- הכנס את מחסנית עם DNA מצופה microparticles (מוכן בשלב 1) לתוך האקדח. עבור ארבידופסיס, הירי מתבצע בלחצים של 80-110 psi עבור 1-מיקרומטר microparticles, ו 140-160 psi עבור 0.6-מיקרומטר microparticles. עבור נ benthamiana וטבק, הירי מתבצע בלחץ של 100-120 psi עבור 1-מיקרומטר microparticles, ו 160-180 psi עבור 0.6-מיקרומטר microparticles. עבור ארבידופסיס, אנחנו בדרך כלל לנצל מחסנית אחת לכל עלה, עלה כי לכל אחד יש שטח מספיק רק ירייה אחת microparticles המשתרע על פני שטח של 10-12 מ"מ קוטר. עם נ 'גדול יותר benthamiana ועלי טבק, הפגזות מרובות העלה אותו הם אפשריים, אך הם חייבים להיעשות עמדות סימטרית בכל צד של הצלע אמצע היעד באזורים עלה בשלב התפתחותי זהה (ראה דיון).
- הסר את העלים מעל פני קלקר ולמקם אותם אנילא צלחת פטרי על 3 שכבות של נייר סינון רטוב Whatman, לאטום את צלחת פטרי עם Parafilm ו דגירה אותו בטמפרטורת החדר למשך 36-48 שעות, כדי לאפשר ביטוי transgenes נמסר פוטנציאל התא אל התא התנועה של מוצרי החלבון שלהם .
4) הדמיה של ביטוי חלבון
אות הניאון של החלבונים המתויגים הביע transiently הוא מדמיין על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש להקפיד למצוא הגדרות אופטימליות במיקרוסקופ לצורך זיהוי של כל חלבון נבדק. לדוגמה, חלבונים להראות הצטברות תאיים מוגבל עם עוצמות אות חלש, כגון לוקליזציה plasmodesmal של חלבון פסיפס טבק תנועה וירוס (TMV MP) 1-3,6, יש לשים לב תחת עדשת אובייקטיבי 40X, אשר מאפשר רזולוציה גבוהה יותר רגישות, ואילו חלבונים להראות הפצה cytoplasmic עם עוצמות איתות חזק, כגון YFP בחינם, ניתן דמיינו תחת עדשת אובייקטיבי 10X עם פונקציית זום confocal הדמיה מהר יותר (ראה איור 1).
תחבורה Symplastic הוא להסיק הופעתו של אשכולות multicell המכילים את האות ניאון. מספר אשכולות כאלה מספר התאים באשכול זה מעיד על היקף התחבורה התא אל התא. כדי לקבל נתונים אמינים, לפחות 100 אשכולות הביטוי צריך להיות לכל נרשם כל מערכת ניסיונית. לדוגמה, אם תנועת התא אל התא של חלבון בהשוואה בשני רקע גנטי שונה (למשל, סוג בר וצמחים מהונדס), של 200 אשכולות סך הביטוי צריך להיות מוקלט. חשוב לציין, ניסויים, תוצאות אשר יש לעומת זה, צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת.
5. נציג תוצאות
האיור שלהלן מדגים ניסויים נציג לצורך זיהוי של תחבורה symplastic של החלבונים המתויגים fluorescently. לוחות A ו-B להראות את התמונות confocal טיפוסי מתקבלים microbombardment הבאות של נ עלה benthamiana עם TMV MP-YFP-לבטא לבנות. בלוח תנועה, symplastic של TMV MP-YFP הוא ציין המבוססת על הופעתו של אשכולות multicell האות YFP. לא כל TMV הביע transiently MP-YFP הוא מסוגל לנוע כפי שמעידים אותות מתא בודד בחלק microbombardments (לוח ב '). סטטיסטית, ב <40% אשכולות אותות ספרתי, TMV MP-YFP אינו מסוגל לנוע בין התאים ואילו> 60% של אשכולות, החלבון נע בין 2-5 תאים, עם התפשטות שני תאים להיות השכיח ביותר (כ ~ 50% מהמקרים) (תרשים 1C).
חלבונים בעלי גודל מולקולרי קטן יחסית ללא פעילות תנועת מולדת יכול לנטרל באמצעות פ"ד לעבור תא אל תא. לדוגמה, YFP חינם, או 1xYFP (בערך 27 kDa, לוח ד '), מתפשט בין תאים בכמה 30% של אשכולות ספרתי (לוחות ג). זו דיפוזיה הלא ספציפית אינו מתרחש עבור דימר YFP translational, או 2xYFP (54 kDa, פאנל E), אשר דומה בגודלו חלבון MP-YFP היתוך TMV (57 KDA), ואשר לחלוטין תאים אוטונומיים (איור 1C).
באיור 1. תוצאות אופייניות שהתקבלו assay התחבורה symplastic ב נ benthamiana עלה רקמות. (A, B) ויזואליזציה של TMV MP-YFP. (ג) quantitation של אשכולות האות. 1xYFP ו 2xYFP, חינם YFP ו translational YFP דימר, בהתאמה. (ד) ויזואליזציה של 1xYFP. (ה) ויזואליזציה של 2xYFP. ב micrographs, לוחות שמאל להראות את האות YFP ואת לוחות הזכות להציג תמונות הממוזגת של YFP (בירוק) ואת autofluorescence הכלורופלסט (בלבן) אותות. תמונות קטעים confocal יחיד. כוכביות ב micrographs את ההצגה בתאי האפידרמיס מראה אות YFP. ברים = 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המפתח להצלחה של assay התחבורה symplastic היא להשיג יעילות הטרנספורמציה גבוהה, המאפשרת ייצור של אשכולות אות מובהק סטטיסטית ו detectible בקלות. זו יכולה להיות מושגת באמצעות עלים שנקטפו מן, צמחים חזקים ובריאים, והכנת חלקיקי זהב מצופה על ידי הכנה דנ"א טהור ומרוכז.
שימוש עלים בשלב צמיחה זהה גם חיוני לאמינות assay. Plasmodesmal הצמצם ידוע להיות מוסדר באופן דיפרנציאלי, בהתאם לשלב ההתפתחותי של רקמת 7-11. עלים של מיני צמחים רבים לפתח basipetally, מן הקודקוד לבסיס, עם החלק apical העלה להיות בוגרת יותר חלק הבסיס שלה 12. לפיכך, לא רק את השלב ההתפתחותי של העלים (משתקף בדרך כלל על ידי גודלם ומיקומם על הגזע) שנבחר עבור כל קבוצה של ניסויים צריך להיות זהה, אבל בתחומים עלה על הכוונת של microbombardment צריך להיות ממוקם ליד עמדות זהות.
כמה מחקרים קודמים יש המועסקים תאים אוטונומיים סמנים, כגון endoplasmic reticulum-GFP קשור (erGFP) 11, להבחין בין תאים הפך בתחילה מאלה שאליהם חלבון נבדק עברה בתחבורה symplastic. עם זאת, מחקר אחר הראה כי הביטוי בו זמנית של כמה אי - תאים אוטונומיים חלבונים עם erGFP יכול לגרום תנועת התא אל התא שלו 13, לחקירה את האמינות של erGFP כסמנים השינוי הראשוני האריך את הקושי בפרשנות של הנתונים מ coexpression ניסויים כאלה. לפיכך, אנו מעדיפים להימנע מציגה הביטוי של חלבון אחר לתוך assay התנועה שלנו, במקום זאת, מסתמכים על ניתוח סטטיסטי של מספרי אשכול האות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה שלנו היא נתמך על ידי מענקים NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA, ובארד ל VC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
