Summary
Makromolekylära handel mellan växtceller kan bedömas genom att tillfälligt uttrycka en fluorescerande-taggade proteinet av intresse samt en analys av intra-och intercellulära distribution av konfokalmikroskopi.
Abstract
Här presenterar vi ett enkelt och snabbt protokoll för att upptäcka och bedöma omfattningen av cell-till-cell makromolekylära transporter i Planta. I detta protokoll är en fluorescerande taggad-proteinet av intresse kortvarigt uttryck i växtvävnad efter biolistic leverans av sin kodning DNA-konstruktion. Intra-och intercellulära distribution av de märkta proteinet analyseras sedan av konfokalmikroskopi. Vi beskriver denna teknik i detalj, vilket ger steg-för-steg-protokoll för att analysen och bedöma omfattningen av symplastic protein transport i tre växtarter, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana och N. tabacum (tobak).
Protocol
Bakgrund
Symplastic transport av makromolekyler genom anläggningen intercellulära anslutningar, plasmodesmata, är av intresse för många växt-patologer och biologer. Till exempel finns flera virala proteiner kända för att reglera plasmodesmal storleksbegränsningar utanförskap till att virus rörelse 1-3. Dessutom är vissa kroppsegna proteiner, bland dem viktiga utvecklings-regulatorer, antas flytta från cell till cell, förmodligen genom plasmodesmata, att fungera icke-cell-självständigt 4. Således är en pålitlig metod för att identifiera och visualisera makromolekylära transport mellan växtceller mycket efterfrågade.
1) Växa målet växter
För hög omvandling effektivitetsskäl bör frisk, robusta växter användas.
1. Arabidopsis växter
Väx en Arabidopsis anläggning på Pro-Mix BX i en kruka (10 cm x 10 cm x 10 cm) i en miljö-kontrollerad kammare med en kort fotoperiod (8 tim i 130-150 μE m -2 s -1 ljus vid 23 ° C/16 hr mörker vid 20 ° C) och 40-65% relativ luftfuktighet i 6 till 8 veckor 5. Befruktar dem ibland med kommersiellt tillgängliga produkter enligt beskrivningen 5. Lämnar med storleken större än 15 mm x 35 mm (längd mätningen omfattar bladskaft) väljs ut för experimenten.
2. N. benthamiana och N. tabacum
Odla en anläggning på Pro-Mix BX i en kruka (20 cm x 20 cm x 20 cm) i en miljö-kontrollerad kammare med en lång fotoperiod (16 tim i 130-150 μE m -2 s -1 ljus vid 23 ° C / 8 h mörker vid 20 ° C) och 40-65% relativ fuktighet under 7 till 10 veckor. Befruktar dem ibland med kommersiellt tillgängliga produkter beskriva. Blad med större storlek än 50 mm x 70 mm för N. benthamiana, eller 100 mm x 125 mm för N. tabacum (dessa längd mätningar inkluderar inte bladskaft) väljs ut för experimenten.
2) Förberedelse av Gene Gun bläckpatron med DNA-belagda Guld mikropartiklar
Protokollet för detta experimentella steg har beskrivits i detalj tidigare 6. Det är mycket viktigt att använda väl renat plasmid-DNA vid höga koncentrationer (~ 1 mikrogram / l) för att erhålla den högsta omvandlingseffektiviteten för enkel konfokalmikroskopi analys under de senare stadierna av experimentet.
För denna analys är det viktigt att säkerställa att den behandlade kassetten inte förvandla två eller flera angränsande celler samtidigt på hög frekvens, för att antalet celler som umgås med en fluorescerande signal kluster används som en indikator på omfattningen av symplastic transporter (dvs. , en enda cell som innehåller signal indikerar ingen rörelse, medan en Multicell signal kluster indikerar rörelse). Kvaliteten på varje patron kan kontrolleras genom att analysera uttrycket av proteinet 16-20 timmar efter bombardemanget. Vår protokoll 6 tillverkar patroner som ger Multicell uttryck kluster bara <3% av alla uttryck händelser i denna tidsram och därför lämplig för detta experiment.
3) Biolistic Leverans av DNA-belagd mikropartiklar
- Ta bort bladen på samma utvecklingsstadium (dvs med samma storlek och samma ålder, se steg 1) med ett vasst rakblad och omedelbart placera dem med abaxial sidorna uppåt på en plan frigolit yta. Den abaxial sidan av bladet är ett bättre substrat för beskjutning på grund av dess lägre trichome densitet och tunnare nagelband. Arabidopsis löv på grund av sin relativt ringa storlek, ska täckas med en bit fönsterfilm nät, och nätet sedan säkras med pushpins till frigolit ytan. Att upprätthålla lämnar platt ökar effektiviteten i partikel leverans och minimerar vävnadsskada under microbombardment.
- Sätt i kassetten med DNA-belagd mikropartiklar (beredd enligt steg 1) i pistolen. För Arabidopsis är skjutningen utförs vid ett tryck av 80-110 psi för 1-ìm mikropartiklar och 140-160 psi för 0,6-ìm mikropartiklar. För N. benthamiana och tobak, är skjutningen utförs vid ett tryck av 100-120 psi för 1-ìm mikropartiklar och 160-180 psi för 0,6-ìm mikropartiklar. För Arabidopsis använder vi oftast en patron per blad, eftersom varje blad har tillräckligt med yta bara för ett skott som sprider mikropartiklar över ett område på 10-12 mm i diameter. Med större N. benthamiana och lämnar tobak, flera beskjutningar av samma blad är möjliga, måste de emellertid göras på symmetriska positioner på varje sida av mitten av revbenet för att rikta bladet områden på samma utvecklingsstadium (se diskussion).
- Ta bort bladen från frigolit ytan och placera dem iinte en petriskål på 3 lager av vått Whatman filterpapper, försegla petriskål med Parafilm och inkubera det i rumstemperatur i 36-48 tim för att kunna utföra den levererade transgener och potentiella cell till cell förflyttning av sina proteinprodukter .
4) Imaging av Protein Expression
Den fluorescerande signal taggade övergående uttryckta proteinerna är visualiseras genom konfokalmikroskopi. Försiktighet bör vidtas för att hitta optimala mikroskopi inställningar för upptäckt av varje testad protein. Till exempel, proteiner som visar begränsat intracellulär ackumulering med svag signal intensiteter, såsom plasmodesmal lokalisering av tobak viruset rörelse protein (TMV MP) 1-3,6 bör observeras under en 40X objektiv, vilket ger högre upplösning och känslighet, medan proteiner som visar cytoplasmiska distribution med stark signal intensiteter, som gratis YFP, kan visualiseras i en 10X objektiv med konfokala zoom funktion för snabbare bildhantering (se figur 1).
Symplastic transporter framgår av utseendet på Multicell kluster som innehåller fluorescerande signal. Antalet sådana kluster och antal celler i varje kluster visar på omfattningen av cell-till-cell transporter. För att få tillförlitliga uppgifter, bör minst 100 uttryck kluster redovisas för varje experimentella system. Till exempel bör om cell-till-cell förflyttning av ett protein jämfördes i två olika genetiska bakgrund (t.ex. vildtyp och transgena växter), av totalt 200 uttryck kluster spelas in. Viktigt, experiment bör vars resultat ska jämföras med varandra, utföras samtidigt.
5. Representativa resultat
Figuren nedan illustrerar representant experiment för detektion av symplastic transport av fluorescerande taggade proteiner. Paneler A och B visar de typiska konfokala bilder som erhålls efter microbombardment ett N. benthamiana blad med en TMV MP-YFP-uttrycker konstruktion. I panel A symplastic rörelse TMV MP-YFP observeras bygger på utseende Multicell kluster av YFP signalen. Inte alla tillfälligt uttryckt TMV MP-YFP kan röra sig, vilket framgår av encelliga signal i vissa microbombardments (panel B). Statistiskt hos <40% av de räknade signalen kluster är TMV MP-YFP oförmögen att röra sig mellan celler medan> 60% av kluster, flyttar proteinet mellan 2-5 celler, med de två-cell sprids är den mest frekventa (ca ~ 50% av fallen) (Figur 1C).
De proteiner med relativt liten molekylstorlek utan medfödda rörelse aktivitet kan diffundera genom PD flytta cell till cell. Till exempel sprider gratis YFP eller 1xYFP (ca 27 kDa, panel D) mellan flera celler i 30% av de räknade kluster (paneler C). Denna icke-specifik diffusion uppstår inte för en translationell YFP dimmer eller 2xYFP (54 kDa, panel E), vilket är jämförbart i storlek med TMV MP-YFP fusionsprotein (57 kDa), och som är helt cell-autonoma (Figur 1C).
Figur 1. Typiska resultat erhålls från symplastic transporter analysen i N. benthamiana blad vävnader. (A, B) Visualisering av TMV MP-YFP. (C) Kvantifiering av signal kluster. 1xYFP och 2xYFP, gratis YFP och translationell YFP dimer, respektive. (D) Visualisering av 1xYFP. (E) Visualisering av 2xYFP. I micrographs, den vänstra panelerna visar YFP signalen och höger sida visar fusionerade bilder av YFP (i grönt) och kloroplast autofluorescens (i vitt) signaler. Bilderna är ensamstående konfokala sektioner. Asterisker i micrographs visar epidermala cellerna visar YFP signal. Barer = 50 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyckeln till framgång för symplastic transporter analysen är att med hög omvandlingseffektiviteten, som möjliggör produktion av statistiskt signifikanta och lätt spårbar signal kluster. Detta kan uppnås genom att använda bladen skördas från friska, robusta växter och förbereda guldpartiklar belagda med en ren och koncentrerad DNA-förberedelser.
Använda bladen på samma tillväxtfas är också avgörande för analysen tillförlitlighet. Plasmodesmal bländare är känt att differentiellt regleras, beroende på utvecklingsstadiet av vävnaden 7-11. Blad av många växtarter utvecklas basipetally, från toppen till botten, med den apikala delen av bladet är mer mogna än sina basala del 12. Därför bör inte bara utvecklingsstadiet av bladen (vanligen återspeglas av sin storlek och placering på stjälken) väljs ut för varje uppsättning experiment vara identiska, men bladet områden som omfattas av microbombardment ska placeras på samma ståndpunkt.
Vissa tidigare studier har sysselsatt cell-autonoma markörer, såsom endoplasmatiska retiklet-uppbundna GFP (erGFP) 11, för att skilja en början förvandlat celler från dem, som de testade proteinet har flyttat med symplastic transporter. Emellertid visade en senare studie att samtidig uttryck av vissa icke-cell-autonoma proteiner med erGFP kan inducera sin cell till cell rörelsen 13, ifrågasätter tillförlitligheten i erGFP som initial omvandling markörer och kraftigt öka svårigheten i tolkningen av data från sådant coexpression experiment. Därför föredrar vi att inte införa uttryck av ett annat protein i vår rörelse analys, och i stället förlita sig på statistisk analys av siffror signal kluster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vårt arbete stöds av anslag från NIH / NIGMS, NSF USDA / NIFA, and Bard till VC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
References
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes. Virology. 344, 169-184 (2006).
- Epel, B. L. Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases. Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).
- Zambryski, P. C., Crawford, K. Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).
- Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. Growth of plants and presercation of seeds. Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Oparka, K. J. Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves. Cell. 97, 743-754 (1999).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11, 309-322 (1999).
- Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices. Development. 126, 1879-1889 (1999).
- Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Roberts, A. G. Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus. Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).
- Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana. Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).
