このビデオでは、我々はマウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離し、クローン網膜球体を形成する文化の中で、それらを成長させる方法を紹介します。分離されている球は、幹細胞の枢機卿性質を有している:自己再生および多能。
成体マウスの網膜幹細胞(RSC)は、哺乳類の目1,2,3の毛様体上皮(CE)に見られる珍しい静止細胞です。 CEは、非色素内側と色素外側の細胞層から構成され、そしてCEからの単一色素細胞から生じるクローンRSCコロニーはすべて形成するために区別することができます両方の色素と非色素細胞で構成されています神経網膜とRPEの細胞型。球内のすべての細胞はすべて、少なくともいくつかの顔料4を含むかどうかについてのいくつかの論争があり、しかし細胞はまだ1月3日神経網膜内に存在する異なる種類の細胞を形成することができる。このような両生類や魚類などのいくつかの種においては、彼らの目はしかし、怪我の5の後の再生が可能です。哺乳類の目にはそのような再生特性を示していない。我々は、in vivoで幹細胞を識別し、目のけがの修復物理的または遺伝的モデルを助けるために、細胞の潜在的なソースとして使用しているだけでなく、さらに損傷後、6-8静止哺乳類の網膜幹細胞を維持するメカニズムを理解しよう9月12日移植による。ここでは、クローン網膜幹細胞の球体を形成するために、マウスの眼から毛様体上皮細胞を分離し、文化の中で、それらを成長させる方法について説明します。 in vivoで幹細胞の既知のマーカーが存在しないため、これらの球はプロスペクティブに眼の毛様体上皮内に幹細胞集団を識別するための唯一の知られている方法です。
このプロトコルは1-3マウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離する方法について説明します。毛様体上皮の細片を単離するための方法論は、しかしながら、単一細胞懸濁液を達成するための酵素と方法論は、このプロトコルに最適化されている、変えることができます。それは、これらは各々の眼から単離することができる球の総数にマイナスの影響を持っているように見えるので、分離されている毛様体上皮のストリップはRPEまたは角膜を大量に含まれていないことも重要です。さらに、我々は、もともとbrainニューロスフェアを13日に策定され、その作成 することを無血清培地は、網膜幹細胞の球を成長させるための理想的です。一つは、また、それらが成長している球が一緒に14を集計しないように播種し、インキュベータ内に配置された後、細胞に障害が発生していないことを確認する必要があります。
網膜幹細胞がクローン性の球を形成した後、それらは眼あたりの幹細胞の見込み数を得るためにカウントすることができます。球体は、その後、単一細胞に解離さと把握自己再生能力に継代または成長因子および/またはタンパク質の異なる組み合わせを使用して神経網膜とRPEの異なる細胞型に分化することができます。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、彼女の貴重な援助のためにローラクラークに感謝。幹細胞ネットワーク、CIHRとNIH:この作品は、NCEによってサポートされています。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |