Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.
O adulto do rato com células-tronco da retina (RSC) é uma célula quiescente rara encontrada no epitélio ciliar (CE) do olho de mamífero 1,2,3. A CE é composta por não-pigmentada interior e camadas de células pigmentadas exterior, e as colônias clonais RSC que surgem a partir de uma única célula pigmentada da CE são feitas de ambas as células pigmentadas e não pigmentadas que podem ser diferenciadas para formar todos os tipos de células da retina neural e RPE. Existe alguma controvérsia sobre se todas as células dentro das esferas contêm pelo menos cerca de 4 pigmento, porém as células ainda são capazes de formar os diferentes tipos de células encontradas na retina neural 1-3. Em algumas espécies, como anfíbios e peixes, seus olhos são capazes de regeneração após a lesão 5, no entanto, o olho dos mamíferos não mostra tais propriedades regenerativas. Procuramos identificar as células-tronco in vivo e para compreender os mecanismos que mantêm a retina de mamíferos as células-tronco quiescentes 08/06, mesmo após a lesão, bem como usá-los como uma fonte potencial de células para ajudar a reparar os modelos físico ou genético de lesão ocular através do transplante 9-12. Aqui nós descrevemos como isolar as células ciliares do epitélio do olho do rato e cultivá-las em cultura, a fim de formar a esferas clonal das células da retina-tronco. Como não existem marcadores conhecidos da célula-tronco in vivo, estas esferas são a única maneira conhecida para prospectivamente identificar a população de células-tronco dentro do epitélio ciliar do olho.
Este protocolo descreve como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do mouse ocular 1-3. A metodologia para isolar as tiras de epitélio ciliar pode variar, no entanto as enzimas e metodologia para alcançar uma suspensão de uma única célula foram otimizados neste protocolo. Também é importante que as tiras do epitélio ciliar que foram isolados não contêm grandes quantidades de RPE ou córnea uma vez que estes parecem ter um impacto negativo sobre o número total de esferas que podem ser isoladas de cada olho. Além disso, os meios de comunicação sem soro que fazemos que foi originalmente formulado para o cérebro neurospheres 13, é ideal para o cultivo de células da retina esferas tronco. Deve-se também certificar-se que as células não sejam perturbados depois de terem sido banhado e colocado na incubadora para que as esferas de crescimento não se agregam em conjunto 14.
Uma vez que as células-tronco da retina formaram esferas clonal, que pode ser contado para obter um número potencial de células-tronco por olho. As esferas, em seguida, pode ser dissociada em células individuais e várias passagens para verificar auto-renovação ou capacidades diferenciadas em diferentes tipos de células da retina neural e RPE usando diferentes combinações de fatores de crescimento e / ou proteínas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Laura Clarke pelo seu inestimável apoio. Este trabalho é suportado pelo NCE: Rede de Células-Tronco, CIHR e NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |