I den här videon kommer vi att visa hur man kan isolera näthinnans stamceller från ciliära epitelet av musen ögat och odla dem i kultur för att bilda klonat näthinnan sfärer. De områden som är isolerade har kardinalen egenskaper stamceller: självförnyelse och multipotentiality.
Den vuxna musen retinala stamceller (RSC) är en sällsynt rofylld cell finns inom ciliära epitelet (CE) av däggdjur ögat 1,2,3. CE består av icke-pigmenterade inre och pigmenterade yttre cellager och klonal RSC kolonier som uppstår från en enda pigmenterad cell från CE består av både pigmenterade och icke-pigmenterade celler som kan differentieras för att bilda alla celltyper av neurala näthinnan och RPE. Det finns en viss kontrovers om huruvida alla celler inom de områden alla innehålla åtminstone några pigment 4, men cellerna finns fortfarande i stånd att bilda olika celltyper som finns inom neurala näthinnan 1-3. Hos vissa arter, såsom groddjur och fiskar, deras ögon kan regeneration efter skada 5, dock, däggdjur ögat visar inga sådana regenerativ egenskaper. Vi strävar efter att identifiera de stamceller in vivo och att förstå de mekanismer som håller däggdjursceller näthinnans stamceller vilande 6-8, även efter skada och använder dem som en potentiell källa av celler för att reparera fysiska eller genetiska modeller av ögonskada genom transplantation 9-12. Här beskriver vi hur du kan isolera strålkroppen epitelceller från mus ögat och odla dem i kultur för att bilda klonal näthinnans sfärerna stamceller. Eftersom det inte finns några kända markörer för stamceller in vivo, dessa områden är de enda kända sättet att prospektivt identifiera befolkningen stamceller inom ciliära epitelet i ögat.
Detta protokoll beskriver hur man isolera näthinnans stamceller från ciliära epitelet av musen ögat 1-3. Metoden för att isolera remsor av ciliära epitelet kan variera, men de enzymer och metodik för att uppnå en encelliga fjädring har optimerats i detta protokoll. Det är också viktigt att remsor av strålkroppen epitel som har isolerats inte innehåller stora mängder RPE eller hornhinna eftersom dessa verkar ha en negativ inverkan på det totala antalet områden som kan isoleras från varje öga. Dessutom är det serumfritt media som vi gör som ursprungligen formulerades för hjärnans neurospheres 13, perfekt för att odla retinal sfärer stamceller. Man bör också se till att cellerna inte störs när de har pläterade och placerats i inkubatorn så att den växande sfären inte samlade ihop 14.
När näthinnans stamceller har bildat klonat sfärer, kan de räknas för att få en prospektiv antalet stamceller per öga. Sfärerna då kan sedan skiljas i enskilda celler och passerats för att fastställa självförnyelse funktioner eller differentierade i olika celltyper i neurala näthinnan och RPE med olika kombinationer av tillväxtfaktorer och / eller proteiner.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Laura Clarke för hennes ovärderliga hjälp. Detta arbete stöds av NCE: Stem Cell Network, CIHR och NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |