Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l'auto-renouvellement et multipotentiality.
Les souches de souris adultes des cellules rétiniennes (RSC) est une cellule quiescente rares trouvées dans l'épithélium ciliaire (CE) de l'œil des mammifères 1,2,3. Le CE est composé de non-pigmentées intérieure et pigmentées des couches externes des cellules, et les colonies clonales SRC qui découlent d'une seule cellule pigmentée de la CE sont constitués de deux cellules pigmentées et non pigmentées qui peuvent être différenciés pour former tous les types de cellules de la rétine neuronale et le RPP. Il ya une certaine controverse quant à savoir si toutes les cellules au sein des sphères contiennent tous au moins quelques pigments 4, mais les cellules sont encore susceptibles de former les différents types de cellules trouvées au sein de la rétine neurale 1-3. Chez certaines espèces, comme les amphibiens et les poissons, leurs yeux sont capables de régénération après une blessure 5, toutefois, les yeux des mammifères montre pas de telles propriétés régénératrices. Nous cherchons à identifier les cellules souches in vivo et de comprendre les mécanismes qui maintiennent les cellules souches rétiniennes de mammifères repos 6-8, même après des blessures ainsi que de les utiliser comme une source potentielle de cellules pour aider à la réparation des modèles physiques ou génétiques des lésions oculaires par la transplantation 9-12. Nous décrivons ici comment isoler les cellules épithéliales ciliaires de l'oeil de la souris et les faire grandir dans la culture afin de former la rétine sphères clonale de cellules souches. Comme il n'existe pas de marqueurs connus de la cellule souche in vivo, ces sphères sont le seul moyen connu d'identification prospective de la population de cellules souches au sein de l'épithélium ciliaire de l'œil.
Ce protocole décrit comment isoler des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'oeil de souris 1-3. La méthodologie utilisée pour isoler les bandes de l'épithélium ciliaire peut varier, cependant les enzymes et la méthodologie permettant d'atteindre une suspension à cellule unique ont été optimisés dans ce protocole. Il est également important que les bandes de l'épithélium ciliaire qui ont été isolés ne contiennent de grandes quantités de RPE ou cornée puisque ceux-ci semblent avoir un impact négatif sur le nombre total des sphères qui peuvent être isolés de chaque œil. En outre, les milieux sans sérum que nous faisons qui a été initialement formulé pour le cerveau neurosphères 13, est idéal pour la culture de cellules souches rétiniennes sphères. On devrait également s'assurer que les cellules ne sont pas perturbés après avoir été plaqué et placés dans l'incubateur afin que les sphères de plus en plus ne s'agrègent pas ainsi 14.
Une fois les cellules souches rétiniennes ont formé des sphères clonale, elles peuvent être comptées pour obtenir un nombre potentiel de cellules souches par œil. Les sphères, puis peuvent ensuite être dissociés en cellules individuelles et passages pour vérifier les capacités d'auto-renouvellement ou différenciée selon les types de cellules différentes de la rétine neuronale et RPE en utilisant différentes combinaisons de facteurs de croissance et / ou des protéines.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Laura Clarke pour son aide inestimable. Ce travail est soutenu par des RCE: Réseau de cellules souches, les IRSC et les NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |