在这段视频中,我们将演示如何隔离鼠标眼睫状体上皮视网膜干细胞,并在文化中成长,他们形成克隆视网膜领域。被隔离的领域拥有的干细胞的大是大非特性:自我更新和multipotentiality。
成年鼠的视网膜干细胞(RSC)是一种罕见的的静态细胞内的纤毛上皮细胞的哺乳动物的眼睛 1,2,3(CE) 。行政长官是由无色素的内层和色素外层细胞层,并从单一的行政长官的色素细胞克隆产生的RSC殖民地可分化的细胞色素和非色素形成的所有神经视网膜和色素上皮细胞类型。有一些争议,关于是否所有的领域内的细胞中都含有至少有一些色素4;然而,细胞仍然能够形成不同的细胞类型的神经视网膜1-3内发现。在一些物种,如两栖类和鱼类,他们的眼睛能在伤后5再生的,但是,哺乳动物的眼睛显示没有这样的再生性能。我们设法确定在体内的干细胞和理解的机制,使哺乳动物的视网膜干细胞的静态6-8,甚至伤后,以及使用它们作为一个潜在的细胞来源,以帮助修复眼外伤的物 理或遗传模型通过移植9-12。在这里,我们介绍了如何以隔离从小鼠眼纤毛上皮细胞,并在文化中成长,才能形成克隆视网膜干细胞领域。既然有没有已知的标记的干细胞在体内 ,这些领域是唯一已知的方法来前瞻性地识别内眼睫状体上皮干细胞群。
本协议描述了如何从鼠标的眼睛1-3纤毛上皮细胞的视网膜干细胞的分离。隔离纤毛上皮细胞的条的方法可以有所不同,但是实现一个单细胞悬液,酶和方法已在本议定书的优化。同样重要的是纤毛上皮已被隔离带不包含大量的视网膜色素上皮或角膜,因为这些似乎有一个可从每只眼睛孤立的领域总数的负面影响。此外,我们脑部神经球13的最初制定的,在无血清培养基是日益增长的视网膜干细胞领域的理想选择。人们还应该确保这些细胞不受到干扰后,他们已镀上和放置在孵化器,使不断增长的领域不聚合在一起14。
一旦视网膜干细胞形成克隆领域,他们可以算作得到每眼干细胞的一个准数。球体,然后就可以被分离为单个细胞,并代确定的自我更新能力,或到不同的细胞类型的神经视网膜和视网膜色素上皮生长因子的不同组合和/或蛋白质有区别的。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢劳拉克拉克,她的宝贵援助。这项工作是由罗富国:干细胞网络,CIHR和美国国立卫生研究院支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |