In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.
Die erwachsenen Maus retinalen Stammzellen (RSC) ist eine seltene Ruhe Zelle innerhalb der Ciliarepithels (CE) der Säugetier Auge 1,2,3 gefunden. Die CE besteht aus nicht-pigmentierten inneren und pigmentierten äußeren Zellschichten gemacht, und die klonale RSC Kolonien, die aus einem einzigen pigmentierten Zellen aus dem CE entstehen bestehen sowohl aus pigmentierten und nicht pigmentierten Zellen, die unterschieden werden können an alle die Form Zelltypen des neuronalen Netzhaut und des RPE. Es gibt eine Kontroverse darüber, ob alle Zellen innerhalb der Sphären enthalten alle zumindest einige Pigment 4, allerdings sind die Zellen noch in der Lage der Bildung der verschiedenen Zelltypen innerhalb der neuronalen Retina 1-3 gefunden. Bei einigen Arten, wie Amphibien und Fischen sind die Augen der Lage, die Regeneration nach Verletzungen 5 jedoch, das Auge der Säugetiere zeigt keine solche regenerative Eigenschaften. Wir versuchen, die Stammzellen in vivo zu identifizieren und die Mechanismen, die den Säugetieren retinalen Stammzellen Ruhestrom 6-8 zu halten verstehen, auch nach Verletzungen sowie ihre Verwendung als eine potenzielle Quelle von Zellen zu reparieren körperliche oder genetische Modelle von Augenverletzungen Hilfe durch die Transplantation 9-12. Hier beschreiben wir, wie man den Ciliar Epithelzellen aus der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in der Kultur, um die klonale retinalen Stammzellen Kugeln zu bilden. Da es keine bekannten Markern der Stammzellen in vivo, sind diese Kugeln die einzige bekannte Möglichkeit, prospektiv identifizieren die Stammzell-Population innerhalb der Ciliarepithels des Auges.
Dieses Protokoll beschreibt, wie Retina-Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge 1-3 isolieren. Die Methodik zur Isolierung der Streifen Ciliarepithels kann variieren, aber die Enzyme und die Methodik zur Erzielung einer Single-Zellsuspension wurden in diesem Protokoll optimiert. Es ist auch wichtig, dass die Streifen von Ciliarepithels, die isoliert wurden nicht enthalten große Mengen an RPE oder Hornhaut, da diese offensichtlich einen negativen Einfluss auf die Gesamtzahl der Kugeln, die von jedem Auge isoliert werden müssen. Darüber hinaus wird das Serum-freien Medien, die wir machen, das ursprünglich für die Gehirnentwicklung Neurosphären 13 formuliert, ideal für den Anbau von retinalen Stammzellen Sphären. Man sollte auch darauf achten, dass die Zellen nicht gestört werden, nachdem sie vergoldet worden und in den Inkubator, damit die wachsende Kugeln aggregieren nicht zusammen 14.
Sobald die Netzhaut Stammzellen klonale Kugeln gebildet haben, können sie gezählt, um eine prospektive Anzahl der Stammzellen pro Auge zu bekommen. Die Kugeln dann können dann in einzelne Zellen dissoziiert und passagiert, um festzustellen, Selbst-Erneuerung Fähigkeiten oder differenziert in die verschiedenen Zelltypen des neuronalen Netzhaut und RPE durch verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Proteinen.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Laura Clarke für ihre unschätzbare Hilfe. Stem Cell Network, CIHR und NIH: Diese Arbeit wird von NCE unterstützt.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |