이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.
성인 마우스 망막 줄기 세포 (RSC)은 포유류의 눈 1,2,3의 ciliary 상피 (CE) 내에서 발견된 드문 정지 세포이다. 모두를 형성 CE가 아닌 색소 내부 및 색소 외부 세포 레이어로 구성되어 있으며, CE에서 단일 색소 세포에서 발생하는 clonal RSC 식민지는 차별화된 수있는 두 색소가 아닌 색소의 세포로 구성되어 있습니다 신경 망막과 RPE 세포의 종류. 분야 내의 모든 세포가 모두 적어도 몇 가지 색소 4가 포함되어 있는지 여부에 대한 논란이있다, 그러나 세포는 여전히 1-3 신경 망막 내에있는 다른 세포 유형을 형성 수 있습니다. 등 양서류와 물고기 종 (种)에서는, 그들의 눈을 그러나, 부상 5시 이후엔 재생 능력이있다, 포유류의 눈은 그런 재생 특성을 보여줍니다 않습니다. 우리는 심지어 부상 후뿐만 아니라 안구 손상의 수리 물리 또는 유전자 모델을 도와 세포의 잠재적인 소스로 그들을 사용하여 생체내에서 줄기 세포를 식별하고 6-8 포유류의 망막 줄기 세포가 정지 유지 메커니즘을 이해하기 위해 추구 9-12 통해 이식. 여기서 우리는 clonal 망막 줄기 세포 분야를 형성하기 위해 마우스 눈에서 ciliary 상피 세포를 분리과 문화에서 그들을 성장하는 방법에 대해 설명합니다. 생체내에있는 줄기 세포에 대한 알려진 마커가 없으므로,이 분야는 prospectively 눈 ciliary 상피 내에 줄기 세포의 인구를 식별하는 유일한 알려진 방법입니다.
이 프로토콜은 마우스 눈 1-3의 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. ciliary 상피의 스트립을 격리에 대한 방법론 그러나 단일 세포 현탁액을 달성을위한 효소와 방법론이 프로토콜에 최적화되었습니다, 다를 수 있습니다. 그것은 이러한 각각의 시선에서 격리 수있는 분야의 총 개수에 부정적인 영향을 미칠 것처럼부터 고립되어있다 ciliary 상피의 스트립이 RPE이나 각막의 다량을 포함하지 않는 것이 또한 중요합니다. 또한, 우리가 원래 두뇌 neurospheres 13 공식화 것을 확인하는 혈청이없는 미디어는 망막 줄기 세포 분야의 성장에 이상적입니다. 하나는 그들이 성장하는 분야가 함께 14 집계되지 않도록 도금 및 보육에 배치받은 후 세포가 방해되지 않도록해야합니다.
망막 줄기 세포가 clonal 분야를 형성되면, 그들은 눈 당 줄기 세포의 미래의 수치를 얻기 위해 계산하실 수 있습니다. 분야 다음 다음 단일 셀에 dissociated하고 확인할 자기 갱신 기능을 passaged 또는 다른 성장 요인의 조합 및 / 또는 단백질을 사용하여 신경 망막과 RPE의 서로 다른 세포 유형으로 차별화된 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그녀의 귀중한 도움 로라 클라크 감사합니다. 줄기 세포 네트워크, CIHR 및 NIH :이 작품은 제정신에 의해 지원됩니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |