В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз и вырастить их в культуру в форме клональной сетчатки сферах. Сферах, которые изолированы обладают кардинальные свойства стволовых клеток: самообновлению и multipotentiality.
Взрослых мышей стволовые клетки сетчатки (РКК) является редким покоя клетка найти в ресничного эпителия (CE) из глаза у млекопитающих 1,2,3. CE состоит из непигментированной внутренних и внешних слоев пигментированные клетки, и клональной РКК колоний, которые вытекают из одного пигментированные клетки от CE состоят как пигментированные и не пигментированные клетки, которые могут быть дифференцированы по форме все типы клеток нервной сетчатки и ПЭС. Существует некоторая полемика о том, все клетки в сферах содержат по крайней мере некоторые пигмента 4, однако клетки все еще способны образовывать различные типы клеток найдены в нейронных сетчатки 1-3. У некоторых видов, например, земноводных и рыб, их глаза способны к регенерации после травмы 5, однако, глаза у млекопитающих не показывает таких регенеративные свойства. Мы стремимся к выявлению стволовых клеток в естественных условиях и понять механизмы, которые держат млекопитающих сетчатки стволовыми клетками покоя 6-8, даже после травмы, а также использовать их как потенциальный источник клеток, чтобы помочь восстановить физические или генетические модели повреждения глаз путем трансплантации 9-12. Здесь мы опишем, как изолировать цилиарной эпителиальные клетки мыши глаз и вырастить их в культуру, чтобы сформировать клональной сетчатки сферах стволовых клеток. С Есть не известные маркеры стволовых клеток в живом организме, эти сферы являются единственным известным способом перспективно выявление населения стволовых клеток в ресничного эпителия глаза.
Этот протокол описывает, как изолировать сетчатки стволовых клеток из ресничного эпителия мыши глаз 1-3. Методология выделения полос реснитчатого эпителия может меняться, однако ферменты и методологию для достижения одной клеточной суспензии были оптимизированы в этом протоколе. Важно также, что полосы реснитчатого эпителия, которые были изолированы не содержат большого количества НПП или роговицы, так как эти, как представляется, негативное влияние на общее число сфер, которые могут быть изолированы друг от друга глаз. Кроме того, сыворотки среде, что мы делаем, которая была первоначально разработана для мозга нейросферы 13, идеально подходит для выращивания сетчатки сферах стволовых клеток. Следует также убедиться, что клетки не нарушается после того как они были покрыты и поместили в инкубатор, чтобы растущие сферы не совокупный вместе 14.
После сетчатки стволовыми клетками сформировали клональной сферах, их можно пересчитать, чтобы получить перспективные количество стволовых клеток в глазу. Сферы, то может быть отделена в одиночных камерах и пассировать выяснить самообновлению возможности или дифференцировались в различные типы клеток нервной сетчатки и ПЭС, используя различные комбинации факторов роста и / или белков.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Лаура Кларк за ее неоценимую помощь. Эта работа проводится при поддержке NCE: Стволовые клетки сети, CIHR и NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |