Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Summary

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Abstract

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die häufig bei jungen Erwachsenen. Es wird durch Demyelinisierung und Gliazellen zu erschrecken in Bereichen des Gehirns und des Rückenmarks verbreitet charakterisiert. Diese Läsionen verändern Nervenleitung und induzieren die zu Beeinträchtigungen führende neurologische Defizite, die mit der Lage der demyelinisierte Plaques im ZNS (zB Paraparese, Lähmung, Erblindung, Inkontinenz) variieren.

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Modell für MS. EAE wurde zum ersten Mal versehentlich in den Menschen während der Tollwutimpfung induziert, mit Viren auf Kaninchen Rückenmark gewachsen. Rückstände von Rückenmark injiziert mit dem inaktivierten Virus induzierten ZNS Erkrankungen. Nach diesen Beobachtungen wurde ein erstes Modell der EAE in nicht-menschlichen Primaten mit einer ZNS-Homogenat durch Flüsse und Schwenther in 1935 immunisiert beschrieben. EAE ist seitdem in einer Vielzahl von Arten erzeugt worden und kann verschiedene Kurse je nach Art / Stamm und immunisierende Antigen verwendet folgen. Zum Beispiel Immunisierung Lewis Ratten mit Myelin basisches Protein in Emulsion mit Adjuvans induziert eine akute Modell der EAE, während das gleiche Antigen induziert eine chronische Krankheit bei Meerschweinchen.

Die EAE-Modell beschrieben ist hier durch die Immunisierung von DA Ratten gegen DA Ratte Rückenmark in Emulsion in komplettem Freund-Adjuvans induziert. Ratten entwickeln eine aufsteigende schlaffe Lähmung innerhalb von 7-14 Tagen post-Immunisierung. Klinische Symptome folgen einem schubförmigen Verlauf über mehrere Wochen. Pathologie zeigt große Immunsystem Infiltrate im ZNS und Demyelinisierung Plaques. Besondere Überlegungen für die Betreuung von Tieren mit EAE sind am Ende des Videos beschrieben.

Protocol

Induktion und Überwachung von chronisch-rezidivierenden EAE

Die Emulsion ist eine 1:1-Mischung von Antigen in wässriger Lösung hinzugefügt ergänzt komplettem Freund-Adjuvans. Es ist sehr wichtig, um das Antigen an das Adjuvans und nicht umgekehrt hinzuzufügen!

Es gibt eine Menge von Abfällen, wenn Herstellung und Injektion einer Emulsion. Immer vorzubereiten 1,5 oder 2-mal mehr als das, was Sie brauchen.

Verwenden Sie autoklaviert Mörtel, Pistill, Glasspritzen und Brücken. Alle Kunststoffe sollten steril sein. Das Präparat kann in regelmäßigen Labortisch durchgeführt werden.

1. Vorbereitung des ergänzt adjuvante

Wiegen Sie 30 mg Mycobacterium tuberculosis (Difco Katalog # 231141) und in einen Mörser. Machen Sie in dünne Pulver ohne Druck zu hart, um zu vermeiden brechen die Bakterien. 10 ml komplettem Freund-Adjuvans H37Ra (Difco Katalog # 231131) und mischen. Dies ergänzt adjuvante enthält nun 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transfer in ein Rohr.

2. Vorbereitung der Rückenmark-Homogenat

Sammeln Rückenmark von DA-Ratten (Alter / Geschlecht gleichgültig) und bei -80 ° C eingefroren Wiegen Sie die gefrorenen Rückenmark haben genug, um 1:1 (Gewicht: Volumen) mischen sich mit den ergänzten Adjuvans. Mince das Rückenmark so fein wie möglich mit einer Rasierklinge, um den Mörtel in Abschnitt 1 zu übertragen, und eine Paste mit dem Pistill.

3. Herstellung der Emulsion

1. Legen Sie ergänzt komplettem Freund-Adjuvans in einem Rohr. Vortex mit hoher Geschwindigkeit. Fügen Sie die Rückenmark-Homogenat tropfenweise unter Vortexen. Wenn alle Rückenmark-Homogenat hinzugefügt wird, Wirbel für weitere 5 Minuten. Die Mischung sollte wiederum hellrosa.
   
   
2. Legen Sie die Emulsion in einem 5 ml Glasspritze und verknüpfen es mit weiteren 5 ml Glasspritze mit einer 18G-Brücke (Fisher Katalog # 14-825-17L). Senden Sie die Emulsion aus einer Spritze auf der anderen, bis sie hart (5-10 min) wird. Wenn mehr als 5 ml Emulsion hergestellt wird, nutzen mehrere 5 ml Spritzen KEINE größere Spritzen.
   
   
3. Die Emulsion kann in die Spritzen bei 4 ° C für 3 Wochen gelagert. Ich empfehle bereitet es mindestens 12 Stunden im Voraus zu überprüfen, ob sie nicht brechen. Es sollte auch weiterhin dick und nicht getrennt in 2 Phasen. Die Farbe wird über Nacht ändern, um eine hellgelbe oder beige.

4. Die Immunisierung der Ratten

1. Mix der Emulsion in die Spritzen für ein paar Minuten und Transfer zum Spritzen für die Injektion verwendet. Inject 200 ul subkutan in die eigentliche Basis des Schwanzes mit 23G Nadeln und 3 ml Luer-Lock Spritzen unter kurzfristigen Anästhesie.
   
   
2. Die Empfänger sind 7-9 Wochen alte weibliche DA-Ratten. Wir bekommen unsere Ratten von Harlan-Sprague Dawley.
   
   
3. Ratten sollte zweimal täglich beobachtet und gewogen täglich. Klinische Symptome sind 7-15 Tage nach der Injektion der Emulsion zu erwarten.
   

Klinische Wertung:

0: keine Krankheit

0,5: distalen schlaffen Schwanz

1: schlaffe Schwanz

2: mild Paraparese, Ataxie

3: mäßige Paraparese, die Ratten Reisen von Zeit zu Zeit

3,5: ein Hinterbein des Körpers ist gelähmt, die andere bewegt sich

4: komplette Hinterbein Lähmung

5: komplette Hinterbein Lähmung und Inkontinenz

6: moribund, Atembeschwerden, nicht essen oder trinken. Euthanize sofort.

Discussion

Es gibt ein paar wichtige Überlegungen für dieses Protokoll.

Genetik der DA-Ratten wird etwas anders sein je nachdem, welche Züchter werden sie von gekauft. Diese Unterschiede können Zu-oder Abnahme der Empfindlichkeit von Ratten die Induktion EAE. Wenn Ihr Ratten anfälliger für EAE sind, werden Sie wollen, um die Stärke der Immunisierung unter Verwendung von nicht-ergänzten komplettem Freund-Adjuvans oder sogar unvollständig Freunds Adjuvans reduzieren. Sie können sich auch die Verringerung der Menge der Emulsion injiziert oder Verdünnung der Rückenmark-Homogenat mit Kochsalzlösung vor der Zubereitung der Emulsion. Wenn Ihr Ratten entwickeln keine klinischen Anzeichen der EAE mit der full-strength Immunisierung Emulsion ist die Sauberkeit Ihrer Wohnanlage. Ratten, die mit Parasiten (zB Maden) infiziert sind, werden nicht entwickeln EAE. Sie können prüfen, Unterbringung Ihrer Tiere unter sauberen Bedingungen in Käfige autoklaviert mit Filter-Tops, und ihnen angesäuertem Wasser ad libitum (das Protokoll für die Vorbereitung angesäuertem Wasser angeschlossen ist).

Die Emulsion muss Wasser-in-Öl sein, so dass das Öl in der adjuvanten komplett beschichten das Antigen fügen Sie tropfenweise. Eine Emulsion hergestellt umgekehrt (Öl-in-Wasser) wird so dick geworden, aber nicht in der enzephalitogenen.

Ratten sind freundliche Tiere, wenn sie ihre Handler gewöhnt sind, ist es daher eine gute Idee, sie sanft behandeln täglich vor der Injektion des enzephalitogenen Emulsion. Dies reduziert Stress und das Risiko eines Bisses.

Tiere mit schweren EAE (Score von 3 oder mehr) brauchen besondere Pflege. Ratten sollten niemals am Schwanz, sondern vom Körper aufgenommen werden. Dies ist umso wichtiger, zum Abbau von Stress bei kranken Tieren. Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass alle Tiere Zugang zu Futter und Wasser haben, indem sie Essen und Gel-Packs in den Betten und versorgt sie lang sipper Rohre auf dem Wasser-Flaschen. Ratten, die mit EAE weiterhin essen und trinken, wenn ein Tier zu stoppen entweder essen oder trinken Sie bei Ihrem Instituts Tierarzt oder einschläfern des Tieres. Kranke Ratten sollten von gesunden Tieren getrennt werden, um sicherzustellen, dass sie nicht ständig mit Füßen getreten, aber verhindern, dass Ratten allein, da sie soziale Tiere und brauchen Gesellschaft.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s Adjuvant	Reagent	Fisher Scientific	DF 311-360-5	Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Reagent	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Manufactured by Difco
DA rat	Animal	Harlan Laboratories		Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B
Metal bridge - 18G	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml	Tool	BD Biosciences	309585
Needles - 20G 1 1/2	Tool	Fisher Scientific	14-826-5C