Summary
וידאו זה מדגים את הניקוד אינדוקציה קליני במודל חיה של טרשת נפוצה: כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית התובע חולדות. המחלה, הנגרמת על ידי חולדות מחסנת עם תחליב המכיל חוט השדרה שלם חולדה adjuvant פרוינד של שלמה, מציג סימנים קליניים דומים מחלות אנושיות.
Abstract
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כי בדרך כלל משפיע על אנשים צעירים. הוא מאופיין על ידי demyelination ו מפחיד גלייה באזורי המופץ במוח ובחוט השדרה. נגעים אלה לשנות הולכה עצבית ו להשרות את הגירעונות נוירולוגיות השבתת המשתנות בהתאם למיקום של הפלאק demyelinated את מערכת העצבים המרכזית (למשל, paraparesis שיתוק, עיוורון, אי שליטה).
Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) הוא המודל של טרשת נפוצה. EAE הושרה first בטעות במהלך חיסון נגד מחלת הכלבת בבני אדם, באמצעות וירוסים גדל על מיתרי השדרה ארנב. שאריות של השדרה מוזרק עם נגיף מומת המושרה המחלה במערכת העצבים המרכזית. בעקבות תצפיות אלה, המודל הראשון של EAE תוארה פרימטים שאינם בני אדם שחוסנו עם CNS homogenate על ידי נהרות Schwenther בשנת 1935. EAE מאז שנוצר במגוון המינים יכולים לעקוב אחר קורסים שונים בהתאם המין / זן ו מחסנת אנטיגן בשימוש. לדוגמה, מחסנת חולדות לואיס עם חלבון המיאלין הבסיסי תחליב עם גורם משלים מודל חריפה של EAE, בעוד אנטיגן אותו גורם מחלה כרונית שרקנים.
המודל EAE המתואר כאן הוא המושרה על ידי מחסנת חולדות התובע כנגד חוט השדרה עכברוש התובע אמולסיה ב adjuvant פרוינד של שלמה. החולדות לפתח שיתוק רפה עולה תוך 7-14 ימים לאחר החיסון. סימנים קליניים בעקבות קורס בשלב ההתקפי במשך מספר שבועות. פתולוגיה מראה מחלחל החיסונית גדולים CNS ושלטים demyelination. שיקולים מיוחדים בטיפול בבעלי חיים עם EAE מתוארים בסוף הוידאו.
Protocol
אינדוקציה וניטור של EAE-כרונית ההתקפי
התחליב הוא תערובת 01:01 של אנטיגן בתמיסה מימית להוסיף בתוספת adjuvant המלא של פרוינד. חשוב מאוד להוסיף את אנטיגן כדי adjuvant ולא להיפך!
יש הרבה פסולת בעת ביצוע והזרקת אמולסיה. תמיד להכין 1.5 או פי 2 יותר ממה שאתה צריך.
השתמש מרגמה העלי autoclaved, מזרקים זכוכית, גשרים. פלסטיק כל צריך להיות סטרילי. ההכנה ניתן לעשות זאת על ספסל מעבדה רגילים.
1. הכנת adjuvant שיושלם
לשקול 30 מ"ג של Mycobacterium tuberculosis (קטלוג Difco # 231141) ומקום לתוך מרגמה. הפוך את לאבקה דקה מבלי ללחוץ חזק מדי כדי למנוע שבירת חיידקים. הוסף 10 מ"ל של שלמה adjuvant פרוינד של H37Ra (Difco קטלוג # 231131) ומערבבים. זה משלים בתוספת כעת מכיל 4 מ"ג / מ"ל שחפת Mycobacterium. מעבירים צינור.
2. הכנת homogenate חוט השדרה
איסוף מיתרי השדרה של חולדות התובע (גיל / מין אדישים) ולאחסן קפוא ב -80 ° C. לשקול את מיתרי השדרה קפוא יש מספיק לערבב 01:01 (משקל: נפח) עם adjuvant להשלימו. לקצץ את מיתרי השדרה כמו קנס ככל האפשר בסכין גילוח, להעביר מרגמה השתמשו בסעיף 1, ולעשות הדבק עם העלי.
3. הכנת התחליב
- המקום מלא בתוספת adjuvant של פרוינד בצינור. וורטקס במהירות גבוהה. הוסף את טיפת חוט השדרה homogenate על ידי ירידה בעוד vortexing. כאשר כל homogenate חוט השדרה הוא הוסיף, מערבולת במשך 5 דקות נוספות. התערובת צריכה להפוך ורוד בהיר.
- שים את התחליב של מזרק 5 מ"ל זכוכית ולקשר אותו מזרק עוד כוס 5 מ"ל באמצעות גשר 18G (קטלוג פישר # 14-825-17L). שלח את התחליב של מזרק לצד השני עד שהוא הופך קשה (50-10 דקות). אם יותר מ -5 מ"ל תחליב מוכן, השתמש מספר 5 מזרקים מ"ל אין להשתמש מזרקים גדולים יותר.
- התחליב ניתן לאחסן מזרקים ב 4 ° C למשך 3 שבועות. אני ממליץ להכין את זה לפחות 12 שעות מראש כדי לבדוק שזה לא להישבר. זה צריך להישאר עבה ולא נפרדת 2 שלבים. הצבע ישתנה לילה באור צהוב או בז'.
4. חיסון של החולדות
- מערבבים את התחליב של מזרקים במשך כמה דקות ומעבירים מזרק המשמש הזריקה. 200 μl להזריק מתחת לעור בבסיס הזנב מאוד של שימוש במחטים 23G ו - 3 מ"ל Luer-Lock מזרקים תחת הרדמה לטווח קצר.
- הנמענים הם 7-9 שבועות חולדות הישן נקבה התובע. אנחנו מקבלים חולדות שלנו הרלן-ספראג Dawley.
- חולדות יש לשים לב פעמיים ביום ומשקלו יומי. סימנים קליניים צפויים 7-15 ימים לאחר הזרקה של התחליב.
קלינית ניקוד:
0: לא מחלה
0.5: זנב רפוי דיסטלי
1: זנב רפוי
2: paraparesis קל, אטקסיה
3: paraparesis מתונה, החולדות טיולים מעת לעת
3.5: אחת הגפיים האחוריות משותקת, המהלכים אחרים
4: איבר שלם שיתוק האחוריות
5: איבר שלם שיתוק האחוריות בריחת שתן
6: נשימה הגוססת, קושי, אין לאכול או לשתות. להרדים מיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם כמה שיקולים חשובים עבור פרוטוקול זה.
גנטיקה של חולדות התובע יהיה שונה מעט בהתאם מגדל הם קנו. הבדלים אלה עשויים להגדיל או להקטין את הרגישות של חולדות EAE אינדוקציה. אם חולדות שלך רגישים יותר EAE אתה רוצה לצמצם את כוחו של חיסון באמצעות אי - בתוספת adjuvant המלא של פרוינד או משלים שלם אפילו של פרוינד. אתה יכול גם לשקול הפחתת כמות אמולסיה מוזרק או דילול homogenate חוט השדרה עם מלוחים לפני הכנת תחליב. אם חולדות שלך אינם מפתחים סימנים קליניים של EAE באמצעות כוח מלא מחסנת אמולסיה לבדוק את ניקיון במתקן הדיור שלך. עכברושים נגועים טפילים (כגון מרצעית) לא יפתחו EAE. אתה יכול לשקול דיור חיות בתנאים שלך מנקה בכלובים autoclaved עם מסנן ראשי, ולתת להם מים acidified כרצונך (פרוטוקול להכנת מים acidified מצורפת).
התחליב יש מים בתוך שמן, כך שמן משלים לחלוטין את המעיל אנטיגן תוסיף טיפה אחר טיפה. אמולסיה מוכן להפך (נפט ב-מים) יהפוך בעובי אך לא יהיה encephalitogenic.
חולדות הם בעלי חיים ידידותיים אם הם רגילים המטפל שלהם, ולכן כדאי לטפל בהם בעדינות על בסיס יומי לפני הזריקה של התחליב encephalitogenic. זה יהיה להפחית את הלחץ ואת הסיכון של נשיכה.
בעלי חיים עם EAE חמור (ציון של 3 או יותר) צריך טיפול מיוחד. חולדות לא צריך להיות נטל על הזנב, אלא על ידי הגוף. זה אפילו יותר חשוב להפחתת הלחץ בבעלי חיים חולה. חשוב מאוד כדי להבטיח כי כל בעלי החיים יש גישה למזון ולמים על ידי הצבת חבילות מזון ג'ל תשתית ומתן ארוך קשית צינורות על בקבוקי מים. חולדות עם EAE ימשיכו לאכול ולשתות, אם להפסיק חיים או אכילה או שתייה להתייעץ עם וטרינר המכון שלך או להרדימו. חולדות חולים צריכים להיות מופרדים מן החי בריא כדי להבטיח שהם לא נרמס ללא הרף, אך להימנע חולדות לעזוב לבד מאז הם חיות חברתיות צריך חברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CB ו KGC הם מייסדי ויועצים עבור Airmid בע"מ
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s Adjuvant | Reagent | Fisher Scientific | DF 311-360-5 | Manufactured by Difco |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Reagent | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Manufactured by Difco |
| DA rat | Animal | Harlan Laboratories | Females, 7-9 weeks old. | |
| Glass syringes - 5 ml | Tool | Fisher Scientific | 14-823-10 B | |
| Metal bridge - 18G | Tool | Fisher Scientific | 14-825-17L | |
| Luer Lok plastic syringes - 3 ml | Tool | BD Biosciences | 309585 | |
| Needles - 20G 1 1/2 | Tool | Fisher Scientific | 14-826-5C |
